Влажные химии и пептидный иммобилизации на политетрафторэтилена для улучшенного клеточной адгезии

Общая цель этой процедуры заключается в обеспечении обработки поверхности на основе влажной химии для цветочного углеродного полимера политетрафторэтилена или ПТФЭ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, такие как повышение биосовместимости медицинских полимеров. Основное преимущество этого метода заключается в том, что требуется минимум оборудования, и что метод более широко применим по сравнению с другими методами.

Приготовление раствора нафталинида натрия нуждается в строго ангидрологических условиях. Нарежьте 0,25 грамма металлического натрия на мелкие кусочки для улучшения растворения. Добавьте металлический натрий в раствор 1,4 грамма нафтелина в 20 миллилитрах тетрагидрофурана в стеклянной бутылке объемом 100 миллилитров с завинчивающейся крышкой, оснащенной магнитной мешалкой с покрытием из ПТФЭ.

Умеренно нагрейте раствор для дальнейшего улучшения растворения. Конечный раствор имеет темный, слегка зеленоватый цвет, и может храниться в строго сухих условиях. Выбейте диски из ПТФЭ диаметром 12 миллиметров из фольги толщиной 0,5 миллиметра.

Отметьте одну сторону, и чистым является изо-пропанол. Инкубируйте образцы ПТФЭ по отдельности в активирующем растворе в течение одной-двух минут с помощью щипцов. Изменение цвета с белого на темно-коричневый свидетельствует об успешном лечении.

Впоследствии дважды промыть ТГФ, а затем изо-пропанолом. Окисляйте обработанные образцы в 30%-ной перекиси водорода, содержащей 20%-ную трихлорацетиновую кислоту, в течение трех часов. Промойте водой, и высушите.

Поверхность теперь имеет легкий коричневатый вид. Окисленные диски обработайте 50% HMDI в сухом ТГФ в течение двух часов. Затем промойте ТГФ и дайте высохнуть.

Наконец, гидролизуйте изоцианатсодержащие образцы в воде в течение двух-трех часов и высушите. Поместите каждый аминированный диск отмеченной стороной вверх в отдельные лунки 24-луночной пластины. Добавьте 1,5 миллилитра раствора эпоксида, обеспечив полное покрытие образцов.

После инкубации в течение двух часов два раза промойте водой, и один раз карбонатным буфером. На дно отдельных лунок из свежей 24-луночной пластины добавьте 50 микролитров пептида по 0,5 миллиграмма на миллилитр и 50 миллимолярных карбонатных буферов, pH девять, содержащих 0,1% азида натрия. Аккуратно поместите функционализированные эпоксидной смолой диски вверх дном на капли пептидного раствора.

Убедитесь, что пространство между дном лунки и диском из ПТФЭ полностью увлажнено из-за капиллярного действия. Инкубируйте планшет не менее трех часов или на ночь во влажной камере с увлажненной атмосферой, что достигается путем помещения влажной папиросной бумаги на дно камеры. После инкубации трижды промыть водой и стерилизовать в воде с 50% изопропанолом в течение не менее 30 минут.

Перед посевом клеток, как описано в текстовом протоколе, промойте образцы в стерильном фосфатно-солевом буфере. Результаты важнейших этапов химической реакции контролировались с помощью инфракрасной спектроскопии. Первоначальная активация нафталамидом натрия создает двойные связи и, в меньшей степени, гидроксильные функции.

Сигнал, указывающий на двойные углеродные связи, исчезает при окислении, в результате чего на поверхности образуются почти исключительно гидроксильные группы. Изменения цвета в результате активации и окисления согласуются с ожидаемым химическим составом. Ожидается, что сопряженные системы двойного связывания будут коричневатыми, а потеря систем двойного связывания приводит к осветлению.

Кроме того, с помощью сканирующей электронной микроскопии исследован возможный исход активации и окисления на морфологии поверхности. Практически не наблюдалось вредного эффекта от лечения. Иммобилизация адгезивного пептида эндотелиальных клеток, аргинина, глутамина, аспарагиновой кислоты валина на поверхности полимера, поддерживает рост эндотелиальных клеток.

В то время как практически не происходит клеточной адгезии и пролиферации на необработанном материале, модификация убедительно поддерживает колонизацию в течение двухнедельного периода. Например, для клинического применения модификация была идентично выполнена на исходном материале из коммерчески доступного трансплантата, изготовленного из расширенного ПТФЭ, с аналогичными результатами в течение одной недели. После освоения эта техника занимает около 12 часов.

Следует иметь в виду, что данная процедура специфична для ПТФЭ. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как поверхностно активировать ПТФЭ и как иммобилизовать пептиды на последующих этапах. После этой процедуры другие молекулы, такие как полисахариды или факторы шнура, могут быть иммобилизованы аналогичным образом.

Имейте в виду, что работа с высокотоксичными и коррозионными химическими веществами опасна, и что необходимо соблюдать стандартные меры предосторожности.