Сотовый Patterning на фотолитографически установленными Parylene-C: SiO 2 Подложки
7 марта 2014 г.
Этот протокол описывает способ микротехнологий-совместимый для клеток паттерна на SiO 2. Предопределенный дизайн парилен-С фотолитографически напечатаны на SiO 2 пластин. После инкубации с сывороткой (или другого решения активации) клетки придерживаться специально для (и расти в соответствии с соответствием), лежащей в основе Parylene-C, в то время как отбиваясь от SiO 2 регионах.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы смоделировать клетки на основе диоксида кремния в соответствии с заранее определенным дизайном паралина. Это достигается путем предварительного создания фотомаски нужного узора. Второй шаг заключается в окислении и последующем покрытии кремниевой пластины паралином.
Следующие фотолитографические процессы, выполняемые в чистых помещениях микроэлектроники, используются для выборочного травления паралинового покрытия для выявления желаемого дизайна. Заключительным этапом является активация чипов с помощью первой кислоты пираньи, а затем инкубация в сыворотке плода телят в течение 3-12 часов, после чего клеточная суспензия может быть применена для культивирования. В конечном счете, структура клеток может быть оценена либо с помощью визуализации живых клеток с помощью препарирующего микроскопа, либо после фиксации с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Основное преимущество этой методики перед несколькими существующими платформами для моделирования клеток заключается в том, что нет необходимости заносить биологические агенты в чистую комнату. Кроме того, чипы можно хранить неограниченное время, пока они не будут активированы сначала паракислотой, а затем сывороткой. Чтобы спроектировать желаемую конфигурацию paraline C, используйте программный пакет для редактирования макетов, который способен считывать и записывать два файла CIF или GDS.
Передайте производителя фотошаблонов на аутсорсинг соответствующему предприятию микроэлектроники или сделайте его собственными силами. Если оборудование существует, то окислите кремниевую пластину в атмосферной горизонтальной печи при температуре 950 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы получить слой диоксида кремния толщиной 200 нанометров. После этого подтвердите толщину небольшим пятнышком.
Спектроскопический рефлектометр. Поместите пластины в систему вакуумного осаждения, нанесите усилитель синусоидальной адгезии на внутреннюю часть крышки камеры. Во время цикла откачки усилитель синусоидальной адгезии покрывает окисленный паралин загрузки пластины в наплавку печи паралин C при температуре окружающей среды со скоростью 1,3 нанометра на миллиграмм димера с помощью системы вакуумного осаждения.
После этого нанесите усилитель адгезии HMDS на пластину, покрытую паралином. Используя подходящую систему покрытия фоторезистом, вращайте пластину со скоростью 4 000 об/мин в течение 30 секунд при нанесении положительного фоторезиста, чтобы получить толщину в один микрон с помощью системы покрытия фоторезиста, затем мягко запекайте пластину в течение 60 секунд при температуре 90 градусов Цельсия. Теперь вставьте пластину и предварительно изготовленную фотомаску в выравниватель маски.
Подвергните пластину, покрытую фоторезистом, воздействию ультрафиолетового света, чтобы перенести желаемый рисунок на фоторезист. После этого выпекайте обнаженную в течение 60 секунд при температуре 110 градусов Цельсия. Затем удалите весь экспонированный фоторезист с пластины, проявив его в соответствующем растворе проявителя в Хоффе незащищенного паралина с использованием системы кислородного плазменного травления для выявления лежащего в его основе диоксида кремния.
Затем храните чипсы после нарезки кубиками в непыльных коробках до тех пор, пока они не понадобятся. При этой процедуре удалите остатки фоторезиста со стружки, промыв ацетон в течение 10 секунд. Затем промойте их в деионизированной дистиллированной H2O три раза, после чего заварите свежую кислоту пираньи в вытяжном шкафу с кислотой, очистите и протравите стружку, погрузив ее в пианную кислоту на 10 минут.
Затем трижды промыть чипсы в деионизированной H2O и переложить в стерильную чашку для культуры в ламинарном проточном тканевом культуральном шкафу. Активируйте чипы для формирования ячеек, поместив по две микросхемы на лунку в планшет с шестью лунками. Далее добавьте два миллилитра фетальной бычьей сыворотки так, чтобы полностью погрузить все чипсы.
Инкубируйте чипсы в сыворотке от трех до 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь извлеките микросхемы из раствора для их активации. Постирайте один раз в течение 10 секунд в сбалансированном солевом растворе Хэнка.
Затем поместите чипсы в культуральную лунку и планшетируйте выбранный тип клеток в виде суспензии в ее обычной питательной среде. Оптимальная плотность покрытия ячеек зависит как от типа ячейки, так и от геометрического рисунка паралина C на микросхеме. Плотность пять умно-10 на четвертую клетку на миллилитр является разумной отправной точкой.
Визуализация подбирается в соответствии с основной мотивацией для формирования структуры клеток, но поведение живых клеток можно легко оценить с помощью препарирующего микроскопа и цифровой камеры с подходящим релейным объективом. Вот визуализация 93 клеток HEC 2 в живых клетках, культивированных на паралине C диоксиде кремния через три дня. Корабли in vitro инкубировались в течение трех часов в эмбриональной бычьей сыворотке, и клетки помещались в суспензию в концентрации от пяти до 10 до 4 клеток на миллилитр.
Паралин С способствует клеточной адгезии, в то время как голый диоксид кремния отталкивает клетки. На этом рисунке показаны иммунофлуоресцентные изображения стволовых клеток, полученных из первичной глиомы человека, выращенных на различных моделях паралина C на диоксиде кремния. Здесь схема иллюстрирует ретикулярный паралин, флуоресцентную микрофотографию неподвижных клеток, окрашенных глиальным фибриллярным кислым белком, и световую микрофотографию живых клеток на том же чипе.
Ниже приведено флуоресцентное изображение, иллюстрирующее окрашенные GFAP клетки на другой конструкции паралина и изображение отражательной способности узла в конструкции паралина со спицами. На этом рисунке показана живая визуализация трех T, 3 L, 1 клеток, культивируемых на паралине C диоксиде кремния. После четырех дней in vitro чипы были активированы в течение трех часов в бычьей сыворотке плода, и клетки были помещены в суспензию в концентрации 5 раз 10 четвертых клеток на миллилитр.
В этом случае платформа не позволяет создавать узоры, при которых клетки становятся одинаково сливающимися в областях Lene C и диоксида кремния. При выполнении этого протокола важно помнить, что активация сыворотки должна произойти сразу после лечения пираньей. Невыполнение этого требования приводит к нарушению процесса создания шаблонов.
Не забывайте, что работа с пиранийской кислотой может быть крайне опасной. Приготовьте и используйте пиранийскую кислоту в вытяжном шкафу для химикатов и убедитесь, что вы носите соответствующие очки, лабораторные халаты и перчатки.
Обзор
В данном протоколе подробно описан метод создания клеточных паттернов на диоксиде кремния (SiO2) с использованием парилена-C. Клетки прикрепляются к областям из парилена-C, в то время как SiO2 препятствует их адгезии, что позволяет формировать контролируемые структуры роста.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Паттернирование клеток
- Микрофабрикация
- Применение в нейронауках
Теоретическое обоснование
- Формирование клеточных паттернов имеет решающее значение для изучения поведения клеток.
- Парилен-C служит субстратом для адгезии клеток.
- Диоксид кремния используется благодаря его репеллентным свойствам по отношению к клеткам.
- Данный метод позволяет избежать загрязнения биологическими агентами в чистых помещениях.
Цель исследования
- Разработать надежный метод создания клеточных паттернов на SiO2.
- Углубить понимание поведения клеток в структурированной среде.
- Представить протокол, минимизирующий риски контаминации.
Используемые методы
- Создание фотошаблона для получения требуемого рисунка из парилена-C.
- Окисление и покрытие кремниевых пластин париленом-C.
- Фотолитографическое травление для проявления рисунка.
- Активация чипов с использованием раствора «пиранья» и сыворотки бычьего плода.
Основные результаты
- Клетки были успешно распределены в соответствии с рисунком из парилена-C.
- Визуализация живых клеток позволила изучить их поведение на структурированных поверхностях.
- Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил характер адгезии и роста клеток.
- Данный метод позволяет неограниченно долго хранить чипы с рисунком до их активации.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к формированию клеточных паттернов.
- Он упрощает процесс за счет исключения необходимости использования биологических агентов в чистых помещениях.
- Перспективные области применения могут включать использование различных типов клеток и паттернов для научных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод паттернирования клеток, совместимый с микрофабрикацией, обеспечивает точный пространственный контроль адгезии клеток на подложках на основе кремния, что способствует разработке воспроизводимых моделей in vitro для нейронаук и исследований заболеваний. Благодаря интеграции со стандартными полупроводниковыми процессами, этот метод облегчает создание масштабируемых платформ, совместимых с многоэлектродными матрицами и системами «лаборатория на чипе». Такой подход снижает риск загрязнения в условиях чистых помещений и позволяет неограниченно долго хранить структурированные чипы до их активации, что повышает гибкость рабочего процесса в исследовательских условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством точной пространственной организации нейрональных или глиальных сетей для изучения взаимодействий, специфичных для конкретных сигнальных путей.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем изоляции клеточных ответов в определенных микросредах, что снижает влияние сопутствующих переменных при фенотипическом скрининге.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность данных о взаимодействии с мишенью за счет возможности проведения контролируемых анализов в сокультурах или анализов с созданием репульсивных границ, имитирующих архитектуру тканей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность к анализу: обеспечивает создание стандартизированных, совместимых с микрофабрикацией подложек, подходящих для высококонтентного имиджинга и электрофизиологического считывания в рабочих процессах с использованием MEA.
- Воспроизводимость: обеспечивает микронную точность паттернов с помощью фотолитографии, что гарантирует согласованное расположение клеток в повторностях для надежного скрининга соединений.
- Масштабируемость: позволяет осуществлять серийное изготовление и неограниченное хранение чипов, что делает возможным развертывание анализа по требованию без повторной обработки в чистой зоне.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирование заболеваний: способствует изучению клеточной физиологии в неврологически значимых системах, включая первичные стволоподобные клетки глиомы человека и нейроны гиппокампа мыши.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от фенотипического скрининга на этапе поиска к доклинической валидации с использованием единообразных субстратных платформ.
- Снижение механистических рисков: позволяет уточнить роль клеточно-специфических молекул адгезии в формировании паттернов, что помогает при выборе мишеней на основе их биологической значимости.
Интеграция в пайплайны и рабочие процессы
Данный метод вписывается в континуум исследований — от ранней валидации мишеней и разработки анализа до доклинического моделирования, особенно для мишеней в области нейротерапии и онкологии, где пространственная организация клеток определяет их функцию.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез, позволяя создавать контролируемые системы сокультивирования или конструкции с отталкивающими границами для выяснения механизмов клеточной коммуникации и модуляции сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу субстратов с количественными результатами с помощью визуализации живых клеток или иммунофлуоресценции, что облегчает сравнение эффектов соединений в различных паттернированных условиях.
- Аналитика: позволяет получать пространственно-разрешенные данные (например, окрашивание на GFAP, показатели конфлюэнтности), которые обеспечивают статистическое сравнение поведения клеток в определенных микроокружениях.
- Трансляционные исследования: связывают работу с доклиническими исследованиями за счет использования релевантных для заболевания типов клеток (например, стволоподобных клеток глиомы человека) и паттернов, имитирующих архитектуру тканей.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой многократно используемую технологию микрофабрикации, а не одноразовый протокол, совместимую со стандартной обработкой пластин и инфраструктурой чистых помещений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности клеточных ответов с помощью пространственно определенных систем культивирования.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость благодаря точности фотолитографии и активации на основе сыворотки, не требующей внесения биологических материалов в «чистую зону».
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего снижения рисков по мишеням на основе их поведения в физиологически релевантных пространственных контекстах.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков, предоставляя данные из моделей, которые лучше отражают организацию на уровне тканей и клеточную гетерогенность.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микрофабрикации, фотолитографии и систем вакуумного осаждения для нанесения и структурирования покрытий из парилена-C.
- Необходим доступ к чистым помещениям, масочным установкам (степперам), установкам плазменного травления в кислороде и спектроскопическим рефлектометрам для контроля технологического процесса.
- Требуется использование стандартизированных протоколов активации (обработка раствором «пиранья» с последующей инкубацией в сыворотке) для обеспечения стабильных результатов структурирования в разных партиях.
- Необходимо адаптировать плотность посева клеток и время инкубации в зависимости от адгезивных свойств конкретного типа клеток и геометрии паттерна.
- Ограниченная универсальность для различных типов клеток из-за зависимости от эндогенных молекул адгезии, что требует эмпирической валидации для новых моделей.
