Сотовый Patterning на фотолитографически установленными Parylene-C: SiO ₂ Подложки

Этот протокол описывает способ микротехнологий-совместимый для клеток паттерна на SiO _2. Предопределенный дизайн парилен-С фотолитографически напечатаны на SiO ₂ пластин. После инкубации с сывороткой (или другого решения активации) клетки придерживаться специально для (и расти в соответствии с соответствием), лежащей в основе Parylene-C, в то время как отбиваясь от SiO ₂ регионах.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы смоделировать клетки на основе диоксида кремния в соответствии с заранее определенным дизайном паралина. Это достигается путем предварительного создания фотомаски нужного узора. Второй шаг заключается в окислении и последующем покрытии кремниевой пластины паралином.

Следующие фотолитографические процессы, выполняемые в чистых помещениях микроэлектроники, используются для выборочного травления паралинового покрытия для выявления желаемого дизайна. Заключительным этапом является активация чипов с помощью первой кислоты пираньи, а затем инкубация в сыворотке плода телят в течение 3-12 часов, после чего клеточная суспензия может быть применена для культивирования. В конечном счете, структура клеток может быть оценена либо с помощью визуализации живых клеток с помощью препарирующего микроскопа, либо после фиксации с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этой методики перед несколькими существующими платформами для моделирования клеток заключается в том, что нет необходимости заносить биологические агенты в чистую комнату. Кроме того, чипы можно хранить неограниченное время, пока они не будут активированы сначала паракислотой, а затем сывороткой. Чтобы спроектировать желаемую конфигурацию paraline C, используйте программный пакет для редактирования макетов, который способен считывать и записывать два файла CIF или GDS.

Передайте производителя фотошаблонов на аутсорсинг соответствующему предприятию микроэлектроники или сделайте его собственными силами. Если оборудование существует, то окислите кремниевую пластину в атмосферной горизонтальной печи при температуре 950 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы получить слой диоксида кремния толщиной 200 нанометров. После этого подтвердите толщину небольшим пятнышком.

Спектроскопический рефлектометр. Поместите пластины в систему вакуумного осаждения, нанесите усилитель синусоидальной адгезии на внутреннюю часть крышки камеры. Во время цикла откачки усилитель синусоидальной адгезии покрывает окисленный паралин загрузки пластины в наплавку печи паралин C при температуре окружающей среды со скоростью 1,3 нанометра на миллиграмм димера с помощью системы вакуумного осаждения.

После этого нанесите усилитель адгезии HMDS на пластину, покрытую паралином. Используя подходящую систему покрытия фоторезистом, вращайте пластину со скоростью 4 000 об/мин в течение 30 секунд при нанесении положительного фоторезиста, чтобы получить толщину в один микрон с помощью системы покрытия фоторезиста, затем мягко запекайте пластину в течение 60 секунд при температуре 90 градусов Цельсия. Теперь вставьте пластину и предварительно изготовленную фотомаску в выравниватель маски.

Подвергните пластину, покрытую фоторезистом, воздействию ультрафиолетового света, чтобы перенести желаемый рисунок на фоторезист. После этого выпекайте обнаженную в течение 60 секунд при температуре 110 градусов Цельсия. Затем удалите весь экспонированный фоторезист с пластины, проявив его в соответствующем растворе проявителя в Хоффе незащищенного паралина с использованием системы кислородного плазменного травления для выявления лежащего в его основе диоксида кремния.

Затем храните чипсы после нарезки кубиками в непыльных коробках до тех пор, пока они не понадобятся. При этой процедуре удалите остатки фоторезиста со стружки, промыв ацетон в течение 10 секунд. Затем промойте их в деионизированной дистиллированной H2O три раза, после чего заварите свежую кислоту пираньи в вытяжном шкафу с кислотой, очистите и протравите стружку, погрузив ее в пианную кислоту на 10 минут.

Затем трижды промыть чипсы в деионизированной H2O и переложить в стерильную чашку для культуры в ламинарном проточном тканевом культуральном шкафу. Активируйте чипы для формирования ячеек, поместив по две микросхемы на лунку в планшет с шестью лунками. Далее добавьте два миллилитра фетальной бычьей сыворотки так, чтобы полностью погрузить все чипсы.

Инкубируйте чипсы в сыворотке от трех до 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь извлеките микросхемы из раствора для их активации. Постирайте один раз в течение 10 секунд в сбалансированном солевом растворе Хэнка.

Затем поместите чипсы в культуральную лунку и планшетируйте выбранный тип клеток в виде суспензии в ее обычной питательной среде. Оптимальная плотность покрытия ячеек зависит как от типа ячейки, так и от геометрического рисунка паралина C на микросхеме. Плотность пять умно-10 на четвертую клетку на миллилитр является разумной отправной точкой.

Визуализация подбирается в соответствии с основной мотивацией для формирования структуры клеток, но поведение живых клеток можно легко оценить с помощью препарирующего микроскопа и цифровой камеры с подходящим релейным объективом. Вот визуализация 93 клеток HEC 2 в живых клетках, культивированных на паралине C диоксиде кремния через три дня. Корабли in vitro инкубировались в течение трех часов в эмбриональной бычьей сыворотке, и клетки помещались в суспензию в концентрации от пяти до 10 до 4 клеток на миллилитр.

Паралин С способствует клеточной адгезии, в то время как голый диоксид кремния отталкивает клетки. На этом рисунке показаны иммунофлуоресцентные изображения стволовых клеток, полученных из первичной глиомы человека, выращенных на различных моделях паралина C на диоксиде кремния. Здесь схема иллюстрирует ретикулярный паралин, флуоресцентную микрофотографию неподвижных клеток, окрашенных глиальным фибриллярным кислым белком, и световую микрофотографию живых клеток на том же чипе.

Ниже приведено флуоресцентное изображение, иллюстрирующее окрашенные GFAP клетки на другой конструкции паралина и изображение отражательной способности узла в конструкции паралина со спицами. На этом рисунке показана живая визуализация трех T, 3 L, 1 клеток, культивируемых на паралине C диоксиде кремния. После четырех дней in vitro чипы были активированы в течение трех часов в бычьей сыворотке плода, и клетки были помещены в суспензию в концентрации 5 раз 10 четвертых клеток на миллилитр.

В этом случае платформа не позволяет создавать узоры, при которых клетки становятся одинаково сливающимися в областях Lene C и диоксида кремния. При выполнении этого протокола важно помнить, что активация сыворотки должна произойти сразу после лечения пираньей. Невыполнение этого требования приводит к нарушению процесса создания шаблонов.

Не забывайте, что работа с пиранийской кислотой может быть крайне опасной. Приготовьте и используйте пиранийскую кислоту в вытяжном шкафу для химикатов и убедитесь, что вы носите соответствующие очки, лабораторные халаты и перчатки.