Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Общей целью данного эксперимента является разработка двумерного субстрата для контроля абсорбции белка и роста клеток. Это достигается за счет использования фотолитографии для изготовления шаблонного мастера, который используется для изготовления штампа A-P-D-M-S для микроконтактной печати. На втором этапе подготавливается узорчатая золотая подложка, которая включает в себя микроконтактную печать для получения рисунка с областями, которые поглощают и сопротивляются белку.

Затем белок и клетки добавляются к субстрату для того, чтобы визуализировать картину и изучить. Получены результаты клеточного роста и поведения, которые показывают хорошее удержание белков и клеток на этих подложках на основе флуоресценции и микроскопии с контрастом лица. Основное преимущество этой методики перед другими существующими методами, такими как MicroCon-печать белков, заключается в том, что монослой, заканчивающийся гликолем, противостоит неспецифическому белку и поглощению клетками на фоне узора.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что правильная техника тиснения должна быть оптимизирована для каждого напечатанного узора. Чтобы начать подготовку мастер-центра с рисунком, нанесите кремниевую пластину на спин-кодер, и на начальном этапе двухтактной программы отжима промойте пластину ацетоном. Во время второго этапа программы отжима ацетон испаряется, оставляя чистую сухую пластину в начале отжима, наносит фоторезист на пластину, а затем отжимает слой, используя условия, описанные ранее.

Мягкая выпечка с фоторезистом при температуре 110 градусов Цельсия в течение двух минут с использованием горячей плиты высокой однородности. Следующий рисунок на фото. Фоторезист покрыт пластиной пластиной с помощью системы выравнивания маски и соответствующей маски.

Сначала поместите подложку на вакуумную тележку выравнивателя маски. Затем вставьте маску в лоток для держателя и включите пылесос, чтобы удерживать маску на месте, чтобы убедиться в хорошем контакте маски с подложкой. Поднимите субстрат до соприкосновения с маской.

Используйте оптику выравнивателя, чтобы убедиться в том, что был установлен хороший контакт. Наконец, включите лампу, чтобы подвергнуть подложку воздействию ультрафиолетового света через литографическую маску. Проявите узорчатую пластину в проявителе в течение одной минуты 45 секунд с легким помешиванием.

Тщательно промойте полупроводниковой маркой, деионизированной водой, и высушите струей газообразного азота для проверки разработки рисунка с помощью микроскопа с УФ-фильтром. Начните эту процедуру с приготовления отвердителя смолы в соотношении 10 к одному по весу. Смесь сигар 180 2 полностью.

Накройте фотоузорчатую со смесью в одноразовой чашке Петри в вакуумной дегасительной машине Дега, накрытой мастером PDMS до тех пор, пока не будут видны пузырьки. Убедившись, что мастер находится на дне блюда, дайте штампу застыть в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 1,5 часов. Когда штамп PDMS будет отвержден, вырежьте штамп из мастера и обрежьте его до соответствующего размера.

Храните марку в закрытом контейнере лицевой стороной вверх, чтобы защитить ее от пыли и мусора. Для подготовки подложек к нанесению металлов сначала обработайте круглые стеклянные покровные стекла кислородной плазмой в течение 10 минут. Затем дважды промыть чехлы деионизированной водой, просушив струей газообразного азота между полосканиями, после промывки водой промыть дважды этанолом, снова просушив струей газообразного азота между полосканиями.

Используя многогнездную систему электронно-лучевого осаждения, нанесите 50 ангстрем титана, а затем 150 ангстрем золота. Не нагнетайте испаритель между нанесением титанового слоя и слоя золота. Промойте штамп PDMS с этанолом и тщательно высушите.

С помощью газообразного азота нанесите раствор для штампа по каплям до полного покрытия. Тщательно высушите штамп с помощью газообразного азота. Микроконтактная печать файла HEXA Decane зависит от особенностей штампа PDMS и является одним из самых сложных аспектов данной процедуры.

Успешная штамповка требует разработки хорошей техники, которая оказывает равномерное давление. Во время штамповки. Для обычной микроконтактной печати на воздухе аккуратно прижмите штамп к золотой подложке и дайте монослою сформироваться в течение 15 секунд.

В качестве альтернативы, для узоров, состоящих из очень мелких деталей и высоких пропорций, поместите золотую подложку в чашку Петри, содержащую 18,2 мега омс деионизированной воды, обеспечивая погружение подложки. Затем аккуратно прижмите штамп к золотой подложке и дайте моно пласту сформироваться в течение 15 секунд. Далее штампованную подложку дважды промыть с помощью этаноловой сушки с газообразным азотом.

После каждой промывки помещайте субстрат в чашку Петри и заливайте субстрат раствором для обратной засыпки. Запечатайте форму парамом, чтобы предотвратить испарение. Дайте фоновому монослою сформироваться в темноте в течение 12-14 часов.

Наконец, снимите узорчатую крышку с раствора для заправки и дважды промойте этаноловой сушкой с газообразным азотом после каждого полоскания. Чтобы нанести белок на узорчатый покровный листок, поместите его либо в маленькую чашку Петри, либо в камеру для клеточных культур Налейте от 500 микролитров до одного миллилитра фосфатно-солевого буфера delcos. DPBS должна полностью покрывать субстрат во время инкубации белка.

Чтобы обеспечить равномерное покрытие белком, добавьте в DPBS концентрированный раствор белка и перемешайте раствор путем пипетирования несколько раз. Инкубируйте белковую смесь с субстратом при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После инкубации тщательно промойте субстрат с помощью DPBS, чтобы удалить несвязанный белок, стараясь не пересушить субстрат и не пропустить его через границу раздела воздух-вода.

После трех полосканий отсасывайте DPBS. Затем добавьте примерно 500 микролитров полной клеточной среды для выращивания для поддержания влажного субстрата. Замените питательную среду, используемую для промывки субстрата.

С помощью свежей среды субстрат теперь готов к покрытию ячейками. Обычно на подложку наносится от 30 до 200 ячеек на квадратный миллиметр. На этом изображении показан штамп A-P-D-M-S, визуализированный под микроскопом, путем размещения элемента штампа стороной вниз на стеклянном покровном листе, масштабная линейка составляет 100 микрометров.

Правильная штамповка приводит к четкому, четкому белковому рисунку, который можно визуализировать с помощью флуоресцентно меченного белка, такого как меченый фибронектин LOR 6 47. Здесь показано ограничение клеток chk one к белковой структуре. Масштабные линейки на этих изображениях имеют размер 100 микрометров.

В качестве альтернативы можно использовать иммуногистохимию для визуализации белковой картины после фиксации SU. Здесь используется конъюгированное антиламинатное антитело LOR 3 50 для визуализации узорчатого ламината, засеянного E 18 нейронами гиппокампа мыши, показано, что через четыре дня in vitro нейроны гиппокампа мыши E18, окрашенные трекером MIT red five 80, показывают, что рост клеток хорошо ограничен белковым паттерном. Несмотря на то, что этот метод легко освоить, может возникнуть несколько общих проблем, как показано на примере этих препаратов субстрата, визуализированных с помощью абсорбции конъюгированного фибронектина по стандарту LOR 6 47.

Применение белка без достаточного перемешивания концентрированного белкового раствора в DPBS может привести к неравномерному распределению белков. Неправильная штамповка может привести к частичному переносу рисунка или схлопыванию штампа. Кроме того, воздействие воздуха на подложку, содержащую поглощенный белок, может привести к разрушению монослоя, что приведет к снижению сопротивления.

В фоновом режиме с помощью погружного шаблона можно создавать узоры с небольшими деталями, которые трудно напечатать с помощью обычной микроконтактной печати и воздуха. На этих двух изображениях показаны разные области одного и того же шаблона, напечатанные одним и тем же штампом PDMS на воздухе или деионизированной водой, линии поддержки показаны на изображении слева, чтобы продемонстрировать, что только небольшие элементы узора не удалось успешно напечатать. Масштабные линейки имеют длину 20 микрометров После освоения эта техника может быть выполнена за 18-24 часа, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить подложку для шаблона. Изготовьте штамп A-P-D-M-S. Используйте микроконтактную печать для подготовки рисунка на золотой подложке и визуализируйте этот узор с помощью белка и клеток.