Оптимизация и использование Agrobacterium Опосредованного переходных Белок Производство в Nicotiana

Общая цель этой процедуры заключается в разработке простого, эффективного и масштабируемого метода производства переходного рекомбинантного белка в системе на растительной основе с использованием техники агроинфильтрации. Это достигается путем оптимизации условий роста растений. Вторым этапом является трансформация агробактерии с помощью пусковых векторов, сочетающих компоненты вирусов растений и бинарных плазмид, с последующим культивированием трансформированной агробактерии для использования в агроэкспериментах.

Во время инфильтрации агробактерий растения переворачивают вверх ногами, а надземные части погружают в суспензию агробактерий. Затем создается вакуум, в результате чего воздух удаляется из межклеточных пространств в тканях листьев. С помощью St Rapid повторное нагнетание давления после сброса вакуума приводит к вливанию суспензии агробактерии в листья.

В конечном счете, иммуноблоттинг и флуоресцентные анализы используются для того, чтобы показать продукцию рекомбинантного белка в инфильтрированных растениях. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ручная инфильтрация, заключается в том, что метод вакуумной инфильтрации может быть масштабирован для промышленного производства рекомбинантных белков, включая вакцины и терапевтические белки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биотехнологии растений и в дальнейшем облегчить использование растений в качестве альтернативной платформы для коммерческого производства рекомбинантного белка.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы узнали, что масштабирование агрофильтрации на почвенных растениях является сложной задачей. По нескольким причинам почва содержит учины, такие как вирусы, бактерии, нематоды, а кроме того, содержание почвы и поливной воды варьируются от партии к партии и от сезона к сезону, а почва яиц со временем находится на хранении. Кроме того, переворачивание почвы, выращивающих растения, приведет к нежелательному попаданию почвы в культуру агробактерий во время инфильтрации.

Эту процедуру будут демонстрировать Ребекка Сноу, старший научный сотрудник лаборатории биологии растений и инженерии, и Эмма Гут Робин Лоуб. Она, она и Адам Тревор, которые являются научным сотрудником из моей лаборатории. В этом исследовании используется гидропонная среда для выращивания растений и питательный раствор для обеспечения равномерности роста растений и устранения сложностей, связанных с использованием почвы для выращивания растений.

Для начала этой процедуры замочите плиты минеральной ваты в растворе удобрения для растений на пять минут, вручную посейте семена на пропитанную питательными веществами поверхность минеральной ваты. В этом исследовании будут оцениваться три вида Nico Oceana, два вида дикого типа, Nico Oceana, Benham Ana и Nico Oceana Excelsior, а также гибрид Benham, Ana и Excelsior по имени Nico Oceana. Excela выращивает растения из семян в контролируемых условиях и длинном дневном фотопериоде в гидропонной каскадной системе.

Nico Oceana, Bentham Miana и Nico Oceana Excela в течение четырех-пяти недель, а Nico Oceana Excelsior в течение пяти-шести недель. Штаммы Agrobacterium tumor Fasion, использованные в этом эксперименте, были преобразованы с помощью соответствующих векторов запуска, как описано в сопроводительной рукописи. Для целей данной демонстрации используются пять трансформированных штаммов агробактерий.

GV 3 1 0 1, несущий репортерный зеленый флуоресцентный белок, или ген GFP GV 3 1 0 1, несущий вирусный ген подавляющего подавления томатного кустистого каскадерского вируса P 19 и A 4 GV 3 1 0 1 и T 10. Несущие ген белка-носителя модифицированной лиазы или лизуна KM выращивают штаммы агробактерий в течение ночи в среде LB, дополненные 50 мг на литр банки мицина при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием при 200-250 оборотах в минуту на следующий день. Приготовьте суспензии агробактерий для желаемых экспериментов, чтобы изучить возможность использования нескольких штаммов агробактерий для получения переходного белка, разбавьте лабораторный штамм и два штамма дикого типа, содержащие вектор PBI в четыре лик-км в миллиQ-воде до оптической плотности при 600 нанометрах 0,5.

Исследовать необходимость индукции генов вирулентности агробактерий до инфильтрации сначала центрифугировали культуры агробактерий, несущих вектор P bid 4G FP, выращенных в среде LB при 4000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем ресуспендируйте в индукционной среде ММА до оптической плотности при 600 нанометрах 0,5 и перемешайте при комнатной температуре в течение двух часов, чтобы проверить, улучшает ли ацетиловый конус выработку переходного белка центрифугой и культурой агробактерий. Несущий вектор PBI 4G FP, выращенный за ночь в среде LB и ресуспендированный в инфильтрационном буфере, содержащем одну соль X ms 10 миллимоляр, MES и 2% глюкозы.

Разделите клеточную суспензию на четыре емкости. Добавьте к каждой из суспензий агробактерий разную концентрацию конуса ацетобактерии и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех часов. Проверить влияние коинфильтрации супрессора вирусного сайленсинга на смесь продуцирования транзиторного белка GFP.

Культура агробактерии, разведенная в миллиQ, несущая ген GFP, и культура, несущая супрессор вирусного сайленсинга P 19 в соотношении четыре к одному, во время вакуумной инфильтрации растений, что будет продемонстрировано. Далее критически важно контролировать давление вакуума и продолжительность инфильтрации к вакуумным инфильтрационным установкам. Сначала переложите приготовленную суспензию агробактерии в контейнер внутри вакуумной камеры.

Затем переверните растение вверх ногами в разведенной агробактерии и примените вакуум от 50 до 400 миллибар на 30 или 60 секунд. Оптимальная инфильтрация обычно применяется при давлении от 50 до 100 миллибар в течение 60 секунд. Как только вакуум будет нарушен, удалите растения из вакуумной камеры, промойте в воде и выращивайте в течение пяти-семи дней в тех же условиях роста, которые используются для роста с предварительной фильтрацией.

Чтобы подготовить образцы для западного анализа, сначала соберите случайные образцы листьев с растений Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior или Nico Oceana Excela через четыре-семь дней после инфильтрации или измельчите образцы листьев в жидком азоте до мелкого порошка. Добавьте три объема одного буфера XPBS, содержащего 0,5% Triton X 100, в каждый образец и перенесите образец в пробирку эйнора. Осторожно встряхните или поверните извлеченные образцы в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Вращайте экстракт в течение пяти минут и соберите общий растворимый белок в чистую пробирку эйнора. Разбавьте экстракты до соответствующего разбавления в одном экстракционном буфере XPBS и добавьте пять буферов для проб к конечной концентрации в один X. Прокипятите образцы в течение пяти минут перед отделением белков по странице SDS.

После переноса белков на неподвижную Р-транспортную мембрану и детектировать GFP с помощью кроличьей поликлональной анти-GFP анти-GFP антисыворотки в разведении от 1 до 5000 в блокирующем растворе. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа с легким покачиванием после трехкратной промывки мембран одним X-P-B-S-T 20. Инкубируйте с конъюгированными антителами против бедры с пероксидазой хрена, добавьте разведение от одного до 5000 в течение одного часа для обнаружения GFP.

Затем обрабатываются вестерн-блоттинги и анализируются интенсивности полос, соответствующие белкам, как описано в сопроводительной рукописи. Визуальное обнаружение флуоресценции GFP в целом временно трансформированных растениях осуществляется с помощью портативной длинноволновой ультрафиолетовой лампы, цифровой камеры и времени экспозиции 15 секунд для фотографирования временно трансформированных растений через желтый фильтр 8 ES 52. Получение изображений с помощью вестерн-блоттинга с помощью программного обеспечения для отслеживания генома.

Количественная оценка результатов с помощью программного обеспечения для создания генных инструментов с калибровочной кривой на основе очищенного стандарта GFP, Ник Океана Бентам Миана был выращен на плитах Роквелла, пропитанных коммерчески доступными удобрениями, чтобы определить оптимальные условия для роста растений и накопления биомассы. Присутствие фосфора имеет решающее значение для достижения прорастания и роста NICO Oceana. Семена бентама, как показано на примере этих шестинедельных растений, растущих либо в растворе удобрения, содержащем 4,8% фосфора, либо в растворе удобрения, содержащем 0% фосфора.

Влияние роста агробактерий и инфильтрационных сред на здоровье растений и производство белка было изучено путем сравнения продукции GFP у nicotiana. Растения Hamana, инфильтрированные с помощью PBI 4G FP, содержат культуры агробактерий, выращенные в трех разных средах. Культуры YEB AB и LB, выращенные в течение ночи в средах YEB или LB, центрифугировали на низкой скорости и ресуспендировали в среде для индукции MMA или выращивали в течение ночи в среде YEB LB или AB и непосредственно разбавляли от одного до пяти или от одного до 10 водой Milli Q, как показано в этом результате вестерн-блоттинга, растения, инфильтрированные культурами агробактерий, выращенные в среде YEB LB или AB и разбавленные Milli Q. Вода не показала существенной разницы в среднем при производстве GFP из культур, центрифугированных и ресуспендированных в ММА.

Таким образом, вода milli Q рекомендуется для разбавления культур агробактерий для инфильтрации растений и регулярно использовалась в последующих экспериментах для достижения оптической плотности на уровне 600 нанометров 0,5. Затем было изучено влияние плотности суспензии клеток агробактерий и временного хода на экспрессию мишени. Оценивали четыре различные плотности клеточной суспензии агробактерий, несущих PBI 4G FP, и собирали образцы листьев через четыре, семь и 10 дней после инфильтрации или DPI для вестерн-блоттинга при четырех DPI, наблюдались заметные различия во флуоресценции GFP среди растений, инфильтрированных с разной плотностью клеточной суспензии агробактерии Экспрессия GFP не наблюдалась при 600 0,05 при семи D-P-I-G-F-P.

Флуоресценция была сходной у растений, инфильтрированных при клеточной суспензии. Плотности от 601,0 до 0,5 и 0,1, но были ниже имплантаты, инфильтрированные при А 600 от 0,05 при контрасте при 10 DPI. Не наблюдалось различий в продукции GFP среди растений, инфильтрированных с любой из четырех плотностей клеточной суспензии, для увеличения разнообразия штаммов агробактерий, доступных для производства транзиторного белка.

Растения Nicotiana Benham miana были вакуумно инфильтрированы семью различными штаммами агробактерий, содержащими переносчик KBI на четыре километра. Инфильтрированные листья собирали при семи DPI и оценивали уровень экспрессии киназы методом вестерн-блоттинга. Как показано на этом графике, наибольший уровень продукции лиазы был достигнут со штаммами GV 3 1 10, 1 A 4 и LBA 4 4 0 4 с небольшими различиями.

В то время как самый низкий уровень экспрессии был при использовании С, пяти, восьми, С, продуцирование одной промежуточной лиазы было достигнуто с помощью штаммов Т-77, А, Т-ноль, шесть, а ферментативная активность Т-10-лиазы была продемонстрирована с помощью анализа XMO Грэхема. Очищенный белок бактериальной лиазы использовали в качестве положительного контроля активности фермента. Интересно отметить, что растения nicotiana Benham miana, инфильтрированные штаммами агробактерий дикого типа A four и a T seven seven, показали патологические симптомы, такие как задержка роста, удлинение и скручивание домашних животных, а также скручивание листьев при семи DPI.

Симптомы были слабо выраженными у растений nicotiana benham, инфильтрированных диким типом на штамме T 10. На растениях Nico Oceana Benham, инфильтрированных лабораторным штаммом GV 3 1 0 1, не наблюдалось никаких симптомов. Сравнение производства растительной биомассы у диких видов показало, что при одинаковых условиях роста самая высокая биомасса листьев, которая может быть получена из Nico Oceana Excela, примерно в два раза выше по сравнению с Nico Oceana.

Продукция белка Benham была исследована у Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior и Nico Oceana Excela, инфильтрированных штаммом агробактерии. GV 3 1 0 1 Накопление PBI 4G F-P-G-F-P оценивалось на уровне семи DPI в целых инфильтрированных листьях. Визуальное исследование экспрессии GFP под воздействием ультрафиолетового излучения показало равномерное распределение GFP в Nico Oceana Hamana и Nico Oceana Excela и неравномерное распределение в Nico Oceana Excelsior из-за сложности инфильтрации всей области листьев Nico Oceana Excelsior Western blot анализ накопления GFP в этих инфильтрированных листьях при семи DPI показал, что уровень GFP был выше в Nico Oceana Hamana, чем в Nico Oceana Excela и Nico Oceana Excelsior низкий уровень производства белка в Nico Oceana.

Эксельсиор возникает из-за неравномерной инфильтрации и неравномерного распределения накопленного GFP в собранном листе. Чтобы проверить влияние вакуумного давления на листья, растения Nico Oceana Benham были инфильтрированы штаммом агробактерий GV 3 1 0 1, содержащим PBI 4G FP под вакуумным давлением 400, 200, 100 или 50 миллибар при времени удержания вакуума 30 или 60 секунд. Не наблюдалось никаких различий в производстве GFP и умеренного или отсутствующего вредного воздействия на здоровье растений при подаче вакуумного давления 5, 100 и 200 миллибар в течение 30 или 60 секунд.

Влияние продолжительности вакуума на экспрессию мишени оценивали путем инфильтрации в одну квартиру растений Nico Oceana Benham каждый час с помощью A 600 0,5 GV 3 1 0 1, в которых находится PBI 4G FP в течение восьми часов. В той же культуре агробактерий, как показано в этом репрезентативном результате, уровень продукции GFP был одинаковым во все время, с точностью до восьми часов, что позволяет предположить, что в течение этого периода времени агробактерия сохраняет свою способность запускать одноцепочечную ДНК. Поскольку было сообщено, что многие химические вещества и моносахариды усиливают выработку переходного белка у различных видов растений.

В этом исследовании также оценивалось влияние различных концентраций ацето, кринона и глюкозы. При переходном производстве белка GFP в Nico Oceana Benham, Ана инфильтрировалась штаммом агробактерий, GV 3 1 0 1, содержащим PBI 4G FP. Агробактерии выращивали в течение ночи в средах YEB, центрифугировали и ресуспендировали до 600 из 0,5 либо в ММА, содержащем 2% глюкозы с ацетилсероном в указанных концентрациях, либо в ММА, содержащем 200 микромолярного ацетофенона с глюкозой в указанных концентрациях. Как показано здесь, ни одна из протестированных концентраций этих соединений не вызвала значительного увеличения продукции белка GFP по сравнению с контролем, где индукционные среды не содержали ацетофенона или глюкозы.

Далее, влияние коинфильтрации сайленсингового супрессора на транзиторную экспрессию генов GFP и HAC one у Nico Oceana. Листья Бенхама были исследованы до инфильтрации агробактерии GV три одни десять одно-одна культура, содержащая PBI 4G FP и вирусный супрессор P 19 вируса томатного кустистого роста, были соответственно смешаны в соотношении один к одному, два к одному, три к одному и четыре к одному. Как показали результаты вестерн-блоттинга при семи DPI, присутствие P 19 не увеличивало и не уменьшало продукцию GFP у nicotiana Benham Miana при любом соотношении двух взвесей агробактерий.

Кроме того, было исследовано влияние двух супрессоров вирусного гена P 23 и P 19 на профилактику посттранскрипционного сайленсинга гена для HAC one. POS агробактерий, несущих вектор запуска PBI четыре HAC, одну и одну из двух плазмид, подавляющих вирусный сайленсинг, смешивали в соотношении четыре к одному соответственно и совместно инфильтрировали в Nicotiana Bentham Miana. Инфильтрированные образцы листьев были собраны в диапазоне от трех до восьми DPI.

На этом графике показаны средние уровни экспрессии HAC one из трех экспериментов, определенные с помощью вестерн-блоттинга. Совместная инфильтрация Nico Oceana Benham с P 23 или P 19 привела к увеличению выработки HAC one по сравнению с использованием глушителя без глушителя при 60 pi. Это говорит о том, что P 23 и P 19 эффективны в этой системе.

Также было замечено, что как в присутствии, так и в его отсутствии супрессора, уровень продукции белка HAC one начал снижаться при семи DPI. Это указывает на то, что время снижения транзиторной продукции белка у Nico Oceana Benham Miana, инфильтрированного с пусковым вектором, является мишенно-специфичным. Наконец, стабильность банка клеток Agrobacterium оценивается каждый год путем инфильтрации растений nicotiana benham с одной и той же партией банка клеток Agrobacterium для оценки накопления белка.

Эти репрезентативные результаты указывают на то, что продукция белка HA one была очень стабильной в течение более трех лет. Среднее производство HAC one на заводах Nicotiana benam составляет 651 плюс-минус 49,4 миллиграмма на килограмм. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как применять технику агроинфильтрации для производства рекомбинантных белков в больших масштабах, которые могут быть использованы для производства субъединичной вакцины, антител к теобелкам и диагностических антигенов.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о контроле кросса растений гидропонным способом, использовании жизнеспособных агробактерий, контроле вакуумного давления и давления, а также контроле за носителем экспрессии белка. После освоения техника агрофильтрации может быть выполнена за 24 часа, если она выполняется правильно в контролируемых условиях.