Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Общая цель этой процедуры заключается в количественном обнаружении белок-белковых взаимодействий в переходной системе экспрессии. Эта мера может помочь ответить на ключевые вопросы в области транзакций quan-сигналов, например, как количественно контролировать направления белков белка после химической обработки или обработки окружающей среды. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она использует люминометр или ПЗС-камеру для обнаружения люциферной активности, которая представляет интенсивность направления белка белка, что делает результаты более точными.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте один миллилитр раствора, содержащего пятипроцентный гипохлорит натрия и ноль целых одну десятую одного процента тритона х сто, в одну целую пять миллилитров микроцентрифужной пробирки, содержащей семена. Дайте раствору отдохнуть пять минут, чтобы простерилизовать семена. Затем пять раз промойте семена стерильной водой.

Суспензируйте промытые семена в двухстах микролитрах стерильной воды. Тонкими кончиками аккуратно поместите отдельные семена на поверхность покрытой среды MS агара. Храните пластины при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех дней, чтобы синхронизировать прорастание.

После этого средние пластины выдерживают при нормальных условиях роста в течение десяти дней. Перенесите прорастающую рассаду в почву, следя за тем, чтобы не повредить корни. Накройте лоток прозрачной пластиковой крышкой на ночь для поддержания влажности.

Выращивайте растения в контролируемой комнате для выращивания в течение семи недель, когда они будут готовы к проникновению агробактерий tumefaciens. Для начала доставим сто пятьдесят нанограммов плазмид в компетентный штамм клеток GV3101 с a-tumefaciens. Поместите пробирки, содержащие культуру a-tumefaciens, в шейкер и инкубируйте в течение четырех часов.

С помощью стеклянного стержня перенесите культуру из пробирок в среды LB. Культуру a-tumefaciens и LB в среде агара при температуре 28 градусов Цельсия в течение четырех дней. Затем приготовьтесь к инокуляции одной колонии a-tumefaciens с каждой пластины в отдельную пробирку, содержащую три миллилитра жидкой среды LB.

Встряхните при 280 RBM при 28 градусах Цельсия в течение 24 часов, чтобы размножить культуру. Затем переведите 75 микролитров бактериальной культуры в 15 миллилитров свежей жидкой среды LB, содержащей 15 микрограммов на миллилитр канамицина и 50 микрограммов на миллилитр рифампицина. Культивируйте бактерии при 220 об/мин при 30 градусах Цельсия в течение примерно 8 часов, пока OD600 не составит от 0,5 до 1.

После этого переложите культуру в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте при 4000-кратном давлении и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте поддон в 15 миллилитрах раствора для трансформации.

Центрифугируйте при 4000-кратном давлении и 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем повторите этап суспензии и центрифугирования еще раз. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте поддон в 5 миллилитрах раствора для трансформации.

Дайте поддону отдохнуть в течение двух часов при комнатной температуре в темное время суток. Затем либо добавьте раствор трансформации в OD600 равным 0,5, либо объедините два образца с равным объемом для тестирования взаимодействий парных белков. С помощью иглы объемом в один миллилитр шприца инфильтрируйте взвешенные клетки в четвертый-седьмой листы.

После этого сразу же накройте растения черной пластиковой крышкой на 12 часов. Во-первых, растения должны быть очень здоровыми, чтобы обеспечить успех. Во-вторых, убедитесь, что вы не повредите листья в процессе проникновения.

Держите лоток в темноте в течение 12 часов. Затем выращивайте растения в нормальных условиях в течение 2-4 дней до обнаружения активности люциферазы. Чтобы начать метод визуализации, отсоедините инфильтрированный лист.

Выложите весь листок на тарелку с агаровой средой MS. С помощью пульверизатора объемом 50 миллилитров распылите рабочий буфер люциферона на адаксиальную сторону листьев. Затем подержите в темноте 5 минут, чтобы погасить автофлуоресценцию хлорофилла.

Используйте ПЗС-аппарат с меньшим световым охлаждением, охлажденный до отрицательных 30 градусов Цельсия, для получения изображений с временем экспозиции 50 миллисекунд и временем обнаружения люминесценции 1 минута. После этого вырезаем фрагменты листьев из зоны инфильтрации листьев N-бентамианы. Погрузите осколки в 100 микролитров деионизированной воды в лунки на 96-луночную белую пластину.

Добавьте десять микролитров рабочего буфера люциферона. Дайте тарелке отдохнуть 5 минут. Затем выполните любую желаемую специфическую обработку для изучения динамики взаимодействия белков и измерьте люминесценцию непосредственно с помощью коммерческого люминометра.

Здесь показана демонстрация люциферной активности для представления взаимодействий COP 1 SPA 1. Люциферная активность, которая регистрируется с помощью люминесценции, визуализируется ПЗС-камерой. Взаимодействие COP 1 с SPA 1 приводит к мутации функциональной люциферазы в меди.

Затем определяется активность люциферазы при лечении жасмином 8 с течением времени. Взаимодействия COP 1 SPA 1, представленные активностью люциферазы, постепенно снижаются в темноте. Лечение жасмином 8 еще больше снижает эти взаимодействия.

После освоения эта техника может быть выполнена за 1 неделю, после того как растения будут готовы, если она выполнена должным образом. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании здоровья растений. Осторожно проникайте в листья и правильно включайте элементы управления.

После своего развития эта технология открывает путь для исследователей в области сигнальных транзакций для быстрого изучения динамики взаимодействия белковых белков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать растения табака, внедрять агробактерии в листья табака и обнаруживать активность люциферов.