Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков
23 июля 2013 г.
Растения предложить новую систему для производства фармацевтических белков в промышленном масштабе, который является более масштабируемым, экономически эффективным и безопасным, чем текущий парадигмы выражения. В этом исследовании мы сообщаем простой и удобный, но масштабируемый подход ввести целевой ген, содержащий Agrobacterium tumefaciens В растения для временной экспрессии белка.
В данной экспериментальной системе используется агроинфильтрация для эффективной доставки генных конструкций в листья с целью получения высокого уровня рекомбинантного белка. Сначала выращивают растения end hamana в контролируемых условиях в течение шести недель, за три дня до инфильтрации. В день инфильтрации готовят культуры agrobacterium, содержащие целевой ген для экспрессии в растениях.
Введите культуры Agrobacterium в растительную ткань с помощью шприца или вакуумной инфильтрации. Результаты, такие как интенсивность зеленой флуоресценции GFP в листьях табака под воздействием УФ-излучения, демонстрируют высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков в растениях, который сопоставим с современными системами экспрессии на основе клеток млекопитающих, бактерий и насекомых. Агроинфильтрация является эффективным способом введения трансгенов в растительные клетки, что обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков.
Данный метод может быть использован для широкого спектра видов растений. Что наиболее важно, он может быть масштабирован для коммерческого производства фармацевтических белков. Таким образом, этот метод позволяет изучить кинетику и экспрессию GFP и может быть применен к другим белкам, таким как субъединичные вакцины и рекомбинантные моноклональные антитела, а также использоваться при лечении рака и инфекционных заболеваний.
Для успешного проведения эксперимента необходимы оптимальные условия как для бактериальной культуры, так и для растительного материала. Этот процесс инфильтрации проще воспроизвести после визуальной демонстрации. Начните с размещения до 60 торфяных таблеток в лотке для проращивания.
Добавьте четыре литра водопроводной воды и дайте торфяным таблеткам впитать воду в течение двух часов. Теперь поместите по два семени hamana в каждую торфяную таблетку и накройте лоток прозрачным пластиковым куполом для прорастания. Поместите семена в среду с температурой 25 °C и влажностью 84%.
Через две недели после посева снимите купол и пересадите растения в новый лоток. Затем добавьте два литра раствора удобрения Jack's в концентрации 1,48 грамма на литр. Продолжайте выращивать растения при температуре 25 degrees Celsius.
Каждые два дня поддерживайте среду с влажностью 50%. Вносите по два литра удобрения Jack's на один лоток. На четвертой неделе перенесите растения вместе с торфяными таблетками в новый лоток, рассчитанный на шесть растений, для дальнейшего выращивания до шестинедельного возраста.
Выберите четыре шестинедельных растения Nicotiana benthamiana, имеющих по пять-шесть листьев. Три листа используйте для полной инфильтрации штаммами Agrobacterium, несущими интересующие гены. Один лист отведите под отрицательный контроль, а один — для точечной инфильтрации. С помощью иглы сделайте небольшой надрез в эпидермисе на нижней стороне листа, стараясь не проколоть лист насквозь.
Крепко зажмите переднюю сторону первого листа, оказывая при этом легкое противодавление на черешок. Большим пальцем одной руки введите смесь агробактерий в инфильтрационном буфере в черешок с помощью шприца с иглой.
Продолжайте вводить смеси с агробактериями в надрез до тех пор, пока темно-зеленый круг не перестанет расширяться. Затем сделайте новый надрез и повторите инъекции до тех пор, пока весь лист не будет инфильтрован и полностью не станет темно-зеленым. Выполните инфильтрацию первых трех листьев, а для четвертого листа каждого растения используйте инфильтрацию комбинациями векторов, состоящими либо из всех четырех вирусных векторов Gemini, либо из трех векторов magcon.
Кроме того, сделайте по одному надрезу для каждой комбинации штаммов agrobacterium и инокулируйте каждый надрез соответствующей комбинацией. После инокуляции верните растения в комнату для выращивания и наблюдайте за экспрессией белка в период от 2 до 15 дней. После инокуляции поместите кювету в вакуумный эксикатор и перенесите туда три литра буфера для инокуляции, содержащего штаммы agrobacterium.
Затем подключите эксикатор к мембранному вакуумному насосу соответствующей марки. Теперь поместите растение вверх дном на пластину эксикатора и опускайте пластину с растением до тех пор, пока вся система из листа и стебля не будет погружена в инфильтрационный буфер, при этом пластина должна опираться на верхний край кюветы. Затем установите уплотнительное кольцо эксикатора вдоль края.
После установки крышки эксикатора на камеру включите вакуумный насос и начните отсчет времени, когда давление вакуума достигнет 100 millibar. Выключив вакуумный насос, через одну минуту при давлении 100 millibar медленно откройте выпускной клапан эксикатора, чтобы обеспечить проникновение agro bacteria в межклеточные пространства погруженной растительной ткани. Повторите процедуру инфильтрации.
Сделайте один шаг, чтобы обеспечить хорошее проникновение. Затем извлеките растение из осушителя и верните его в вертикальное положение. Переместите растения обратно в комнату для выращивания и контролируйте экспрессию белка в период от 2 до 15 дней после инфильтрации.
Чтобы продемонстрировать эффективность шприцевой инфильтрации агробактерий в ткани растений, мы протестировали экспрессию двух флуоресцентных белков, GFP и Ds red, с использованием двух различных деконструированных растительных вирусных векторов: Gemini viral и magcon. Листья Hamana подвергли полной инфильтрации агробактериями, содержащими Gemini viral векторы. Экспрессия GFP наблюдалась по всей площади листа под УФ-светом, начиная с 2 DPI, и достигла пика накопления к 4 DPI.
Напротив, в листьях, инокулированных magcon-вектором с комбинациями agrobacterium, флуоресценция GFP проявилась только через пять дней после инокуляции (DPI) и достигла своего максимума на седьмой день DPI. В листьях, инокулированных смесями agro-бактерий отрицательного контроля EP one 10 плюс P 19, зеленая флуоресценция не наблюдалась, что указывает на специфичность флуоресценции к гену GFP и на то, что она не была результатом фоновой флуоресценции листьев. При максимальном уровне накопления флуоресценция GFP, экспрессируемого с magcon-вектором, была более интенсивной, чем при использовании вирусного вектора Gemini.
При инфильтрации листьев конструкциями GFP с помощью шприцевого метода с использованием вирусных векторов Gemini для экспрессии обоих флуоресцентных белков на одном листе выраженного некроза не наблюдалось; белки определялись с ожидаемым флуоресцентным цветом в месте инфильтрации. Примечательно, что совместная инфильтрация GFP и DS RED приводила к желтоватой флуоресценции. Также была изучена вакуумная инфильтрация с целью разработки масштабируемого метода агроинфильтрации, который можно использовать для крупномасштабного получения рекомбинантных белков с помощью систем транзиентной экспрессии в растениях.
Как и ожидалось, флуоресценция GFP наблюдалась во всех листьях инфильтрированного растения по сравнению с инфильтрацией с помощью шприца. Этот метод более надежен и позволяет провести инфильтрацию каждого растения за гораздо более короткий промежуток времени. При должном навыке выполнение данной техники занимает 48 часов.
В большинстве случаев этот процесс используется для подготовки культуры Agrobacterium, так как фактическое время инфильтрации составляет всего несколько минут. Для обеспечения оптимальной эффективности агроинфильтрации и целевой экспрессии белков следуйте данному протоколу. Не забывайте контролировать критические параметры, включая условия роста растений, концентрацию Agrobacterium, давление вакуума и продолжительность процедуры в области растительной биотехнологии.
Данный экспериментальный подход может быть использован для изучения разработки и биопроизводства новых фармацевтических белков в широком спектре видов растений. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как использовать агроинфильтрацию для доставки целевых генных конструкций в растение и обеспечения работы систем транзиентной экспрессии растений для получения рекомбинантного белка, сопоставимого по выходу с белками, полученными в культурах клеток млекопитающих, бактерий и насекомых.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен масштабируемый метод получения фармацевтических белков в растениях с использованием Agrobacterium tumefaciens. Данный подход основан на агроинфильтрации для доставки генных конструкций в ткани растений, что обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология растений
- Системы экспрессии белков
- Фармацевтическое производство
Теоретические основы
- Современные системы экспрессии белков имеют ограничения по масштабируемости и стоимости.
- Растения представляют собой безопасную альтернативу для производства фармацевтических белков.
- Agrobacterium tumefaciens является общепризнанным инструментом для переноса генов в растения.
- Системы транзиентной экспрессии позволяют быстро достигать высокого уровня содержания белка.
Цель исследования
- Разработать простой и масштабируемый метод экспрессии белков в растениях.
- Продемонстрировать эффективность агроинфильтрации для доставки генных конструктов.
- Сравнить экспрессию в растениях с традиционными системами.
Используемые методы
- Метод агроинфильтрации для доставки генов.
- Использование растений end hamana, выращенных в контролируемых условиях.
- Подготовка культур Agrobacterium, содержащих целевые гены.
- Оценка экспрессии белка с помощью флуоресцентной визуализации.
Основные результаты
- В тканях растений была успешно достигнута высокая экспрессия рекомбинантного белка.
- Флуоресцентная визуализация показала интенсивную экспрессию GFP в листьях табака.
- Данный метод продемонстрировал преимущества перед системами на основе клеток млекопитающих и бактерий.
- Агроинфильтрация оказалась эффективным методом введения генов.
Выводы
- Исследование подтверждает возможность использования растений для крупномасштабного производства белков.
- Агроинфильтрация является перспективным методом для транзиентной экспрессии генов.
- Данный подход может повысить эффективность производства фармацевтических белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Системы транзиентной экспрессии в растениях позволяют преодолеть ограничения масштабируемости и стоимости, характерные для культивирования клеток млекопитающих при производстве рекомбинантных белков. Агроинфильтрация обеспечивает быструю и высокоуровневую экспрессию терапевтических белков, таких как субъединичные вакцины и моноклональные антитела. Данный подход способствует валидации мишеней и идентификации перспективных соединений на ранних этапах, предоставляя масштабируемую и недорогую платформу для экспрессии белков и функционального скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональную валидацию терапевтических мишеней посредством экспрессии рекомбинантных белков высокого уровня in planta.
- Практическая ценность: предоставляет быструю и масштабируемую систему производства белков для проверки гипотез и анализа сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: способствует сравнительной оценке вариантов белков, векторов или кинетики экспрессии для выбора наиболее перспективных кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественные показатели флуоресценции (например, GFP, DsRed) для стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Практическая ценность: позволяет проводить многоцелевой скрининг на одном листе с помощью инфильтрации шприцем для сравнения векторов или конструктов.
- Масштабируемость: вакуумная инфильтрация позволяет увеличить площадь обрабатываемой поверхности листа и применять метод для видов, не подходящих для инфильтрации шприцем.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает получение рекомбинантных белков в растительных системах, имеющих значение для конкретных заболеваний, для проведения доклинической оценки.
- Механистическое снижение рисков: позволяет осуществлять коэкспрессию нескольких белков (например, GFP и DsRed) для изучения взаимодействий или использования гибридных конструкций.
- Преемственность: связывает этап поиска с доклиническими исследованиями, обеспечивая масштабируемое получение белков для функциональных анализов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод агроинфильтрации вписывается в общий цикл разработки — от валидации мишени и идентификации перспективных соединений до обеспечения доклинических исследований белками, что позволяет осуществлять быстрые итерации и проводить сравнительный анализ.
- Открытия в биологии: Позволяет проверять гипотезы с помощью транзиентной экспрессии генных конструкций для оценки функции и локализации белков.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимый количественный выход белка для проведения скрининговых кампаний с использованием флуоресцентного анализа.
- Аналитика: Измерения интенсивности флуоресценции под воздействием УФ-излучения позволяют получить количественные данные для сравнения уровней экспрессии при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает получение достаточного количества белка для последующих доклинических испытаний при разработке вакцин или терапевтических препаратов.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для экспрессии белков, применимую в различных проектах и для разных классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокий уровень транзиторной экспрессии снижает механистическую неоднозначность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Инфильтрация с помощью шприца обеспечивает простоту и гибкость; вакуумная инфильтрация обеспечивает надежность и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Низкозатратное масштабируемое производство способствует принятию более обоснованных решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию с поправкой на риск на основе выхода белка, кинетики экспрессии и функционального результата.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области выращивания растений, обращения с Agrobacterium и методов инфильтрации.
- Необходимы контролируемые условия выращивания, буферы для инфильтрации, а также вакуумное оборудование или шприцы.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует соблюдения единообразия в возрасте растений, концентрации бактерий и параметров инфильтрации.
- Адаптация для разных видов (например, табака, латука, Arabidopsis) может потребовать оптимизации вакуумного давления и времени инкубации.
- Практические ограничения включают специфическую для каждого вида эффективность инфильтрации и необходимость наличия оборудования для детектирования флуоресценции.
