Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Эта экспериментальная система использует агроинфильтрацию для эффективной доставки генных конструкций к листьям для производства высоких уровней рекомбинантного белка. Во-первых, выращивайте растения хамана в контролируемой среде в течение шести недель, за три дня до проникновения. Подготовьте культуры агробактерий, которые содержат целевой ген, который будет экспрессироваться в растениях в день инфильтрации.

Вносите культуры агробактерий в ткани растений с помощью шприца или вакуумной инфильтрации. Такие результаты, как интенсивность зеленой флуоресценции GFP в листьях табака под воздействием ультрафиолетового излучения, демонстрируют устойчивую экспрессию рекомбинантных белков в растениях, которая конкурирует с современными системами экспрессии бактерий и насекомых млекопитающих. Агроинфильтрация является эффективным способом введения трансгенов в клетки растений, что приводит к высокому уровню экспрессии рекомбинантных белков.

Его можно использовать для широкого спектра видов растений. Самое главное, что его можно масштабировать для коммерческого производства фармацевтических белков. Таким образом, этот метод может дать представление о кинетике и экспрессии GFP и может быть применен к другим белкам, таким как субъединичные вакцины, рекомбинантные моноклональные антитела, а также может быть использован в лечении рака и инфекционных заболеваний.

Для успешного эксперимента необходимы оптимальные условия как для бактериальной культуры, так и для растительного материала. Этот процесс проникновения легче воспроизвести после визуальной демонстрации. Начните с помещения до 60 торфяных гранул в лоток для размножения.

Добавьте четыре литра водопроводной воды и дайте гороховым гранулам впитать воду в течение двух часов. Теперь добавьте два семени хамана в каждую торфяную гранулу и накройте лоток прозрачным пластиковым куполом для проращивания. Поместите семена в среду с температурой 25 градусов Цельсия и влажностью 84%.

Через две недели после посева снимите купол и переложите растения в новый лоток. Затем добавьте два литра по 1,48 грамма на литр. Удобрение Джека Продолжайте выращивать растения при температуре 25 градусов по Цельсию.

Влажность окружающей среды 50% каждые два дня. Подайте два литра удобрений Джека на лоток. На четвертой неделе перенесите растения с торфяными гранулами в новый лоток, в котором размещаются шесть растений для дальнейшего роста до шестинедельного возраста.

Выбирайте четырех-, шестинедельные растения и растения хамамы с пятью-шестью листьями по три листа для полного проникновения в агробактериальные штаммы, несущие интересующие их гены. Один лист для негативного контроля и один лист для точечной инфильтрации. Сделайте небольшую зазубрину иглой в эпидермисе на тыльной стороне листа, следя за тем, чтобы не проколоть лист с обеих сторон.

Крепко возьмитесь за лицевую сторону первого листа, оказывая мягкое противодавление на горлышко. Большим пальцем одной руки. Введите смеси агробактерий в инфильтрационном буфере в горлышко с помощью шприца, иглы.

Продолжайте вводить смеси агробактерий в щель до тех пор, пока темно-зеленый круг не перестанет расширяться. Затем создайте еще одну зазубрину и повторяйте инъекции до тех пор, пока весь лист не проникнет внутрь и весь лист не станет темно-зеленым. Полное проникновение первых трех листьев и последнего листа четвертого листа каждого растения инфильтруйте векторными комбинациями либо всех четырех вирусных векторов Gemini, либо трех магконных векторов.

Кроме того, сделайте по одному нику для каждой комбинации штаммов агробактерий и проникните в каждый ник с помощью одной комбинации. После инфильтрации переместите растения обратно в комнату для выращивания и контролируйте экспрессию белка в период от двух до 15 дней. После инфильтрации поместите ванну в вакуумный адсорбцион и перелейте три литра инфильтрационного буфера, содержащего штаммы агробактерий.

Затем подсоедините влагопоглотитель к вакуумному мембранному вакуумному насосу. Теперь поставьте растение вверх ногами на пластину для сушки и опустите пластину с растением до тех пор, пока вся система листьев и стеблей не будет погружена в инфильтрационный буфер, а пластина будет лежать на верхней части кадки. Затем расположите осушительное уплотнительное кольцо вдоль обода.

После того, как вы накроете камеру крышкой с влагопоглотителем, включите вакуумный насос и начните синхронизацию, когда вакуум достигнет 100 миллибар. После выключения вакуумного насоса через одну минуту медленно откройте выпускной клапан на влагопоглотителе при давлении 100 мбар, чтобы обеспечить проникновение агробактерий в межтканевые пространства погруженных растительных тканей. Повторите это проникновение.

Шаг первый, чтобы обеспечить хорошую инфильтрацию. Затем извлеките растение из десикации и верните его в вертикальное положение. Переместите растения обратно в комнату для выращивания и контролируйте экспрессию белка в период от двух до 15 дней после инфильтрации.

Чтобы продемонстрировать эффективность инфильтрации агробактерий в ткани растений с помощью шприца, мы протестировали экспрессию двух флуоресцентных белков, GFP и Ds red двумя различными деконструированными растительными вирусными векторами, Gemini, viral и magcon. Листья Хамана были полностью пропитаны агробактериями, содержащими вирусные векторы Близнецов. Экспрессия GFP наблюдалась по всей площади листа под действием ультрафиолетового излучения, начиная уже с 2D PI, и достигала пика накопления при четырех DPI.

Напротив, листья, инфильтрированные магконным вектором, содержащим комбинации агробактерий, показали флуоресценцию GFP только после пяти DPI и достигли своего максимального накопления при семи DPI. Зеленая флуоресценция не наблюдалась на листьях, инфильтрированных смесями агробактерий с отрицательным контролем EP 10 плюс P 19, что указывает на то, что флуоресценция была специфичной для гена GFP и не была результатом фоновой флуоресценции листьев. На пике накопления флуоресценция магконного вектора, экспрессируемого в GFP, более интенсивна, чем у вирусного вектора Gemini.

На листьях, инфильтрированных конструкциями GFP, не наблюдалось значительного некроза, когда оба флуоресцентных белка экспрессировались на одном листе с помощью вирусных векторов Gemini с инфильтрацией шприцевого пятна, они обнаруживались с ожидаемым флуоресцентным цветом в месте, куда они были инфильтрированы. Интересно, что совместная инфильтрация GFP и DS RED приводила к желтоватой флуоресценции. Вакуумная инфильтрация также была изучена для разработки масштабируемого метода агроинфильтрации, который может быть использован для крупномасштабного производства рекомбинантных белков с помощью систем переходной экспрессии растений.

Как и ожидалось, флуоресценция GFP наблюдалась для всех листьев инфильтрированного растения по сравнению с инфильтрацией шприца. Он более надежен и может обеспечить проникновение в каждое растение за гораздо более короткий промежуток времени. После освоения этой техники ее можно выполнить за 48 часов.

В большинстве случаев это происходит для агробактериальной культуры, так как фактическое время инфильтрации составляет всего несколько минут для оптимальной эффективности агроинфильтрации и целенаправленного сцеживания белка. Следуйте протоколу. Не забывайте контролировать критические параметры, включая условия роста растений, концентрацию агробактерий, давление вакуума и продолжительность в области биотехнологии растений.

Этот экспериментальный подход может быть использован для изучения разработки и биопроизводства новых фармацевтических белков в широком спектре видов растений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать агроинфильтрацию для доставки целевых генных конструкций в растение и для того, чтобы позволить транзиентным системам экспрессии растений производить рекомбинантный белок, конкурирующий с белком бактериальных культур млекопитающих и клеточных культур насекомых.