Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации сигналов локализации в плазмодесмах целевых белков. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы при изучении межклеточных соединений растений путем выявления критических сигналов, направляющих белки к плазмодесмам, что, в свою очередь, способствует межклеточному транспорту крупных молекул. Основным преимуществом данной методики является надежность процедуры и возможность ее легкой адаптации для поиска последовательностей сигналов локализации в плазмодесмах для большинства белков, нацеленных на плазмодесмы.

Видеодемонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этапы посадки, фильтрации и подготовки к конфокальному наблюдению трудно освоить по обычным печатным публикациям. Посейте семена Nicotiana benthamiana во влажную почву с высокой плотностью посадки. В период роста содержите их в камере с контролируемыми условиями среды при температуре от 20 до 25 °C и световом дне продолжительностью 16 часов с интенсивностью освещения около 75 µmol photons/m²/s.

Когда диаметр стебля *U. fil* достигнет половины сантиметра, осторожно пересадите проростки в более крупные горшки и продолжайте их выращивание в той же камере при тех же условиях. Выращивайте растения до стадии четырех-восьмилистности в течение четырех недель.

К этому моменту самые крупные листья должны достигать четырех-шести сантиметров в диаметре. Для облегчения идентификации и анализа выберите систему экспрессии и пометьте каждый экспрессируемый белок флуоресцентной меткой, как описано в сопровождающем текстовом протоколе. Подготовьте плазмиду на основе pPZP-RCS2 согласно описанию и добавьте 1 µg в культуру компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens объемом 100 µL.

Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Затем подвергните клетки шоковой заморозке в жидком азоте на одну минуту. После этого выдержите клетки при температуре 28 °C в течение 15 минут, а затем добавьте один миллилитр среды LB к смеси компетентных клеток.

После добавления среды LB снова поместите клетки при температуре 28 °C на два часа. Затем центрифугируйте клетки при 3 000 ×g в течение одной минуты. Ресуспендируйте осадок клеток в 0,2 мл среды LB и высейте их на селективные чашки с агаром LB, содержащим антибиотики.

Культивируйте клетки на чашках при 28 °C в течение 48 часов до появления видимых одиночных колоний. Затем выберите несколько одиночных колоний, перенесите их на свежие чашки с агаром LB и культивируйте клетки при 28 °C в течение 48 часов. После этого возьмите небольшое количество бактерий с каждой чашки для анализа и проведите ПЦР-скрининг колоний, чтобы подтвердить наличие искомых специфических бинарных конструкций.

Перенесите каждую колонию agrobacterium с интересующей конструкцией в пять миллилитров среды LB с добавлением соответствующих антибиотиков. Инкубируйте клетки в течение ночи при 28 °C. Затем центрифугируйте клетки при 3,000 ×g. Ресуспендируйте осадок в буфере для агроинфильтрации до достижения OD600 0,5.

Инкубируйте суспензию в течение двух часов при комнатной температуре, затем наберите инокулят в пластиковый шприц объемом один миллилитр. Придерживая полностью развитый лист N.Benthamiana пальцем в перчатке с адаксиальной стороны, прижмите носик шприца к нижней эпидермисе листа. Затем медленно введите агробактерии в среде для инфильтрации, вводя среду шприцем.

Содержите инфильтрированное растение до момента наблюдения. Через 24–48 часов после инфильтрации с помощью лезвия разрежьте каждый лист на фрагменты в области между жилками. Поместите срезы листа на предметное стекло абаксиальной поверхностью листа вверх.

Затем поместите каплю воды на срез листа и накройте его покровным стеклом. Зафиксируйте покровное стекло небольшими кусочками клейкой ленты по краям. Перенесите предметное стекло под лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и с помощью объектива 10X найдите клетки с наиболее интенсивным сигналом.

Затем используйте объектив с увеличением 63X для записи изображений с целью более детального наблюдения. Кроме того, используйте соответствующие флуоресцентные красители для возбуждения экспрессированных флуоресцентных белков. Сохраните все настройки, используемые для получения изображений, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами.

В среднем исследуйте от 100 до 120 клеток для каждого экспериментального условия. Определите локализацию тестируемых белков, используя изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа. На этих изображениях представлены характерные паттерны периферической пунктирной локализации в плазмодесмах, наблюдаемые для полноразмерного белка перемещения TMV, слитого с молекулой груза CFP, и для идентифицированного сигнала локализации в плазмодесмах, слитого с CFP, а также для коэкспрессируемого белка локализации в плазмодесмах PDCB1, слитого с DsRed.

В контрольных условиях таргетинг полноразмерного белка перемещения TMV, слитого с CFP, и сигнала локализации в белке перемещения TMV, слитого с CFP, в плазмодесмы выглядит так, как показано здесь: наблюдается субклеточная локализация CFP и нуклеоцитоплазматическая локализация маркера DsRed2. При замене четвертой аминокислоты, валина, на аланин таргетинг в плазмодесмы как полноразмерного белка перемещения TMV, так и идентифицированного сигнала локализации в белке перемещения TMV утрачивается. Это указывает на то, что данный остаток важен для структуры или функции сигнала локализации в плазмодесмах.

При должном навыке и правильном выполнении эта методика может быть завершена за 50 часов. При проведении данной процедуры важно убедиться, что растения находятся в очень здоровом состоянии и достигли подходящей стадии развития листьев. После просмотра этого видео вы должны не только хорошо понимать, как идентифицировать сигнал белка локализации в плазмодесмах, но и уметь определять другие специфические сигналы в белках растений.