Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

Общей целью данной процедуры является идентификация сигнала локализации плазмодесмат в белках-мишенях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы изучения межклеточных связей растений путем выявления критического мышления в сигналах, которые направляют белки к плазмодесматам, что, в свою очередь, облегчает межклеточный транспорт крупных молекулярных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процедура надежна и может быть легко адаптирована для обнаружения сигнальных последовательностей локализации плазмодесмат в большинстве белков-мишеней плазмодесмат.

Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку фильтрацию растений и подготовку к этапам конфокального наблюдения трудно изучить с помощью типичной печатной публикации. Посадите семена Nicotiana benthamiana во влажную почву и при высокой плотности. Во время роста держите их в контролируемой климатической камере при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия и менее 16 часов света в день, которая содержит около 75 микромолей фотонов на квадратный метр в секунду.

После того как диаметр у. фила достигнет полусантиметра, аккуратно пересадите рассаду в горшки большего размера и продолжайте ее рост в той же камере в тех же условиях. Ухаживайте за растениями до тех пор, пока они не вырастут до стадии четырех-восьми листьев в течение четырех недель.

К этому моменту самые крупные листья должны быть от четырех до шести сантиметров в диаметре. Для упрощения идентификации и анализа выберите систему экспрессии и флуоресцентно пометьте каждый экспрессированный белок, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Приготовьте плазмиду на основе pPZP-RCS2, как описано, и добавьте ее один микрограмм в 100 микролитровую культуру компетентных клеток из Agrobacterium tumefaciens.

Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Затем мгновенно заморозьте клетки в жидком азоте на одну минуту. Далее прогрейте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем добавьте один миллилитр среды LB в подходящую клеточную смесь.

После добавления среды LB поместите ячейки обратно при температуре 28 градусов Цельсия на два часа. Затем уменьшите количество ячеек в 3000 раз G в течение одной минуты. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 0,2 миллилитрах среды LB и наложите их на пластины с селективным применением антибиотиков LB агара.

Выращивайте клетки на пластинах при температуре 28 градусов Цельсия в течение 48 часов, пока не станут видны отдельные колонии. Затем соберите и поместите несколько отдельных колоний на свежие пластины LB-агара и выращивайте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение 48 часов. Затем возьмите небольшое количество бактерий с каждой пластины для анализа и используйте Colony PCR для подтверждения наличия конкретных бинарных конструкций, представляющих интерес.

Добавьте к каждой колонии агробактерий с интересующей конструкцией по пять миллилитров ЛБ среды, дополненной соответствующими антибиотиками. Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 28 градусов по Цельсию. Затем центрифугируйте ячейки при 3000-кратном G. Ресуспендируйте гранулу до OD600 0,5 в агроинфильтрационном буфере.

Выдержите суспензию в течение двух часов при комнатной температуре, а затем загрузите инокулят в пластиковый шприц объемом один миллилитр. Держа полностью созревший лист N.Benthamiana пальцем в перчатке на адаксиальной поверхности, прижмите насадку шприца к нижнему эпидермису листа. Затем медленно вводите агробактерию в инфильтрационную среду путем введения среды.

Поддерживайте инфильтрированное растение до тех пор, пока оно не будет замечено. Используйте лезвие, чтобы разрезать каждый лист на фрагменты между жилками через 24-48 часов после инфильтрации. Поместите срезы листьев на предметное стекло абаксиальной поверхностью листа вверх.

Затем капните каплю воды на ломтик листа и накройте его крышным стеклом. Иммобилизуйте покровное стекло небольшими кусочками скотча с каждой стороны. Перенесите предметное стекло под конфокальный микроскоп с лазерным сканированием и используйте 10-кратную субъективную линзу для идентификации клеток с наилучшим сигналом.

Затем используйте объектив с 63-кратным увеличением для записи изображений для более детальных наблюдений. Кроме того, используйте соответствующие флуоресцентные вещества для возбуждения экспрессированных флуоресцентных белков. Сохраните все настройки, которые используются для получения изображений, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами.

В среднем исследуйте от 100 до 120 клеток для каждого экспериментального условия. Диагностируйте локализацию исследуемых белков с помощью изображений с помощью конфокального микроскопа. Эти изображения иллюстрируют характерные паттерны локализации периферических точечных плазмодесмат, наблюдаемые для полноразмерного белка движения TMV, слитого с молекулой каргоа CFP, и для идентифицированного сигнала локализации плазмодесматы, слитого с CFP, а также для коэкспрессированного белка локализации плазмодесматы, PDCB1, слитого с DsRed.

В контрольных условиях плазмодесматы, нацеленные на полноразмерный белок движения TMV, слитый с CFP, и сигнал локализации в белке движения TMV, слитом с CFP, проявляются, как показано на рисунке, с субклеточной локализацией CFP и нуклеоцитоплазматической локализацией маркера DsRed2. Когда четвертая аминокислота, валин, мутирует в аланин, плазмодесматы, нацеленные как на полноразмерный белок движения TMV, так и на идентифицированный сигнал локализации в белке движения TMV, теряются. Это указывает на то, что этот остаток важен для локализации плазмодесматы, сигнальной структуры или функции.

После освоения этой техники ее можно закончить за 50 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что растения должны быть в очень здоровом состоянии и находиться на правильной стадии листьев. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать не только то, как определить сигнал белка локализации плазмодесматы, но и знать, как идентифицировать другие определенные сигналы в растительных белках.