Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования для количественной оценки эндотелиальной пролиферации, барьерную функцию, и Подвижность

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании измерения импеданса подложки электрической ячейки, известного как eis, для характеристики клеточного поведения. Это достигается путем выращивания клеток на электродах в массиве и проведения измерений в различных режимах для количественной оценки формирования эндотелиального барьера, созревания и функциональных манипуляций, таких как электрические раны и добавление стимуляторов, затем выполняются для проверки подвижности клеток и барьерной функции. Получены результаты, описывающие прикрепление клеток, пролиферацию, миграцию, обнаружение проницаемости эндотелия и оценку контактов клеток, клеток и клеточного субстрата на основе esis.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как обеспечение онлайн-генерации количественных данных, характеристика клеток в их естественном состоянии слияния в стандартных условиях клеточной культуры. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что лежащая в основе теория кажется сложной, и вы должны знать о нескольких основных соображениях, прежде чем начать эксперимент. Для начала матрицы должны быть очищены и стабилизированы, чтобы предотвратить дрейф электродов, улучшить воспроизводимость и увеличить коэффициент мощности сигнала.

Поэтому добавьте 200 микролитров 10 миллимолярного EL ine в каждую лунку восьмилуночного массива через 15 минут При комнатной температуре удалите EL цистин двумя сверхчистыми водными промывками, а не фосфатными буферами. Кроме того, не подвергайте электроды воздействию растворов, содержащих сыворотку, перед нанесением покрытия, так как они могут препятствовать усвоению белка. Далее добавьте в каждую лунку по 200 микролитров подогретого 1%-ного желатина и инкубируйте массив в течение получаса при температуре 37 градусов Цельсия.

Чтобы удалить желатин, используйте сверхчистую воду и не допускайте пересыхания поверхностей электродов. Затем заполните лунки 400 микролитрами полной питательной среды, в которой теперь может содержаться сыворотка. Загрузите массив в держатель.

Проверьте девять золотых квадратов. Они должны контактировать с контактами POGO. Аккуратно закрепите массив на месте рукой, затянув регулировочный винт на компьютере.

Откройте измерительное программное обеспечение. Нажмите кнопку «Настройка», а затем проверьте раздел «Сбор данных», чтобы выполнить быстрое измерение импеданса каждой скважины с частотой по умолчанию 4 000 Гц. Значения будут сохранены в разделе комментариев.

Убедитесь, что при проверке точно выбран тип используемого массива EISs в разделе «Конфигурация скважины» на схеме массива. Красным и зеленым цветом обозначены функциональные возможности подключений. Если очистка и кодирование прошли успешно, восемь массивов W one E sys должны зарегистрировать от пяти до шести массивов NANOFARAD и восемь массивов W 10 E.

Таким образом, базовое сопротивление от 50 до 60 нанофарад перед посевом клеток составляет около 2000 Ом. Чтобы смоделировать данные с помощью RB alpha и cm, начните запись MFT с массивом medium failed. Возьмите 15 минут бесклеточных данных и завершите эксперимент, чтобы добавить клетки.

Теперь извлеките массив и засейте по 400 микролитров одноклеточной суспензии в каждую лунку. Чтобы изучить рост клеток, семена 10 000 клеток на квадратный сантиметр для начала с почти слиянием популяционных семян, 60 000 клеток на квадратный сантиметр. После загрузки массива в держатель в разделе «Конфигурация скважин» выберите скважины для измерения.

Затем переходим к параметрам сбора данных и выбираем режим измерения для временного ряда на фиксированной частоте, выбираем SFT, а также выбираем частоту измерения покрытия электрода и модели RB и альфа выбираем MFT и прибор автоматически проводит измерения на всех доступных частотах. По возможности выполняйте измерение в многочастотном режиме. Для этого требуются данные на всех доступных частотах и, таким образом, обеспечивается наибольшее количество инсайтов.

Для анализа микродвижения выберите RTC и отрегулируйте частоту дискретизации. Стандартное временное разрешение составляет один герц, но может быть увеличено для отслеживания быстрых изменений импеданса. Значение может быть увеличено до 25 герц для z тета.

Чтобы последовательно измерить микродвижение из многих лунок, выберите меню справки. Затем выберите пункт меню «Показать экспертную панель инструментов» и получите и многоскважинный RTC. В разделе сбора данных обязательно укажите ограничение по времени в часах.

При использовании этого параметра программное обеспечение будет запрашивать количество циклов после начала сбора данных. При сборе данных с помощью SFT или MFT выберите временной интервал между измерениями, указанный в секундах. Для получения максимального объема данных не устанавливайте флажок.

Теперь нажмите старт и укажите, где должны храниться данные. Прогон останавливается нажатием клавиши Finish. При нажатии на паузу сбор данных остановится, но экспериментальные часы продолжат ход.

Теперь снимите массив и под ламинарным проточным колпаком проведите манипуляции с лунками. Вернув массив в держатель, нажмите «Проверить соединение», чтобы проверить электрические соединения, а затем возобновите эксперимент, чтобы продолжить сбор данных. Если клетки не нуждаются в стерильности после манипуляции, то такой стимул, как тромбин, может быть добавлен непосредственно в лунку во время сбора данных.

Такие внесенные вариации можно отметить на экспериментальных часах, нажав кнопку «Отметить» и добавив комментарий. Другой вариант – электрическая намотка клеток. Настройки для этого требуют некоторой настройки, чтобы сократить время раны, и это не эффективно слишком долго, и вы можете повредить электроды.

Просто начните с настроек по умолчанию, предоставленных программным обеспечением, и двигайтесь дальше. Перейдите в раздел Настройка электропарада ран и включите намотку. Теперь выберите скважины для намотки в соответствии с конфигурацией скважины.

Будут ранены только проверенные скважины. При нажатии на кнопку «Активировать» появляется всплывающее окно с запросом на ранение. После ранения убедитесь, что сигнал падает до значения электрода, практически свободного от ячеек.

Если ранение в целом не повторялось для работы с данными, воспользуйтесь опцией экспорта данных и выберите Excel. Однако RB и альфа-моделирование могут быть выполнены из программного обеспечения. Исходя из данных MFT, помните, что моделирование допустимо только для слоев ячеек слияния.

И не забудьте добавить ссылку без ячеек. Начните с автоматического выбора бесклеточного опорного напряжения с помощью функции поиска в разделе моделирования и анализа частотного сканирования. Примите значение с помощью set.

Затем нажмите модель, чтобы начать расчеты. Не пугайтесь, если это займет несколько минут. Во время типичного эксперимента клетки переходят из фазы роста в фазу плато.

Когда они достигают слияния, изображения во время этого процесса получаются непосредственно с электрода. Следующим этапом является формирование и созревание EC-барьера. Затем для изучения миграции клеток используется электрическое ранение.

За характерным падением сигнала до исходного уровня следует восстановление состояния слияния. Наконец, реакция на раздражители отслеживается в режиме реального времени. Здесь был применен вазоактивный агент тромбин.

Это вызывало сокращение клеток и, следовательно, временное открытие небольших щелей в барьере, что вызывало снижение сопротивления импедансу, а измерения емкости дают дополнительную информацию о адгезии клеток и сопротивлении росту при наиболее чувствительном измерении. Частота отражает качество и функцию клеточного барьера и учитывает сопротивление парацеллюлярному и трансцеллюлярному потоку тока. Когда элементы присоединяются к электродам, они пропорционально ограничивают протекание тока и падение емкости.

Эта фаза обеспечивает общее измерение покрытия электрода и лучше всего количественно измеряется при регистрации емкости на частоте выше 40 килогерц. Сопротивление дает четкое представление о том, как хорошие клетки могут блокировать ток и, следовательно, качество клеточного барьера. Поэтому клетки разных ходов и разных типов имеют разное сопротивление.

Наши RB и альфа помогают различать адгезии клеточных клеток и клеточного матрикса. RB — это удельное сопротивление контактов ячеек ячейки с текущим потоком, или обратное измерение проницаемости. Альфа — это мера вклада импеданса от электродных переходов ячейки.

Оба значения RB и альфа могут быть рассчитаны в программном обеспечении ISIS. Небольшие колебания сигнала сопротивления могут быть вызваны тонкими движениями в слое клеток слияния или микродвижениями. Они могут быть измерены с помощью одной Е-матрицы на наиболее чувствительной частоте и проанализированы с помощью быстрого преобразования Фурье в рамках программного обеспечения EIS.

Например, можно сделать электрическую рану размером 250 микрон, которая закроется в течение нескольких часов, чтобы изучить миграцию клеток. Импедансная спектроскопия также хорошо подходит для анализа влияния добавляемых веществ. Как отмечалось ранее, тромбин делает клеточный барьер гиперпроницаемым, снижая напряжение базальных клеток с помощью ингибитора ARO киназы, эффект тромбина может быть уменьшен При попытке этой процедуры важно помнить, что ESIS чрезвычайно чувствителен к изменениям в клеточной среде, таким как температура, pH, истощение среды и так далее.

После его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области ологии к изучению тенденций и эффектов вазоактивных агентов на конфлюенсирующие клеточные культуры в режиме реального времени.