Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Общая цель этой процедуры заключается в сравнении концентраций многих белков между образцами с помощью масс-спектрометрии с использованием готовой протеомики. Это достигается путем предварительного переваривания белка из каждого образца для получения пептидных смесей. Затем два образца смешивают, а пептиды в смешанном образце фракционируют и обессоливают.

Затем смешанный образец анализируется с помощью масс-спектрометрии. Наконец, пептиды идентифицируются путем сравнения двух спектров MS с целевой базой данных приманки всех потенциальных пептидов в образцах, а также количественно оценивается относительное содержание пептидов между образцами. В конечном счете, готовая протеомика позволяет количественно оценить относительное содержание многих белков между сложными образцами.

Основные преимущества восстановительного деметилирования по сравнению с другими методами мечения стабильных изотопов, такими как iLite, заключаются в том, что ready является быстрым, недорогим и точным методом, который не требует специальных трех или синтетических носителей, что означает, что его можно применять практически к любому типу образца. Для начала приготовьте один миллиграмм клеточного белка и 500 микролитров с помощью ультразвуковой обработки или френч-пресса, чтобы обработать клетки для осаждения белков. Добавьте один объем трихлоротичной кислоты к четырем объемам белка и охладите на льду в течение 10 минут.

Центрифугируйте при 12 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость. Затем используйте один миллилитр ледяного ацетона для Резуса. Приостановите дробину перед вторым вращением.

После аспирации сната высушите гранулу в термоблоке при температуре 56 градусов Цельсия, чтобы денатурировать белки и уменьшить сульфидные связи красителя. Используйте 500 микролитров денатурирующего и восстановительного буфера для reus. Ресуспендируйте белки примерно до двух миллиграммов на миллилитр.

Инкубируйте белки в течение 30 минут при температуре 56 градусов Цельсия, а затем 10 минут при комнатной температуре. Рядом с алкилатными свободными сульфидными группами добавьте 25 микролитров свежеприготовленного 0,3 моляра IDO ацетамида в воду на 500 микролитров белка и инкубируйте в темноте 20 минут при комнатной температуре. После инкубации погасите реакцию, добавив 10 микролитров трехмиллимолярного DTT.

Храните алкилированные белки при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы переварить алкилированные белки после осаждения ТСА, используйте одну молярную мочевину на 50 миллимоляров при pH 8,2 для ресуспендирования белка. Приготовьте исходный раствор лизола, эндопротеиназы или ly C в воде в концентрации два микрограмма на микролитр и добавьте фермент к переваренному белку в конечной концентрации 10 нанограмм на микролитр, образцы оставляют при комнатной температуре на шесть часов или на ночь. Суспензируйте 20 мкг секвенирующего трипсина в 40 микролитрах 50 миллимолярной уксусной кислоты и добавьте пять микролитров в реакцию переваривания лицея.

Инкубировать в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия до алкилированных белков. Добавьте три: Фторуксусная кислота или ТЖК до конечной концентрации 0,5%Присоедините колонку C 18 к экстракционному коллектору. Затем используйте шесть миллилитров ацетонитрила или CN для увлажнения колонки.

Затем, с максимально возможной скоростью потока, используйте шесть миллилитров 80% CN 0,1% TFA для промывки колонки, прежде чем использовать шесть миллилитров 0,1% TFA для балансировки колонки, остановите давление вакуума и загрузите 500 микрограммов пептидов на колонку со скоростью потока примерно один миллилитр в минуту. Как только пептиды свяжутся с колонкой, снова запустите вакуум и с максимально возможной скоростью потока используйте 0,1% TFA, а затем три миллилитра буфера лимонной кислоты для промывки колонки для проведения онко, восстановительного, тусклого метилирования или готового мечения. Под химический колпак приготовьте по 12 миллилитров легкого и тяжелого готового буфера Tom Methylate пептида free.

А средство добавляют в колонку по 10 миллилитров либо легкого, либо тяжелого готового буфера со скоростью расхода один миллилитр в минуту. После наносится второй 10 миллилитров аликвоты. Для обеспечения маркировки используют шесть миллилитров 0,1% ТЖК, затем один миллилитр 0,5% уксусной кислоты.

Чтобы промыть колонку для элюирования белков, остановите вакуум и внесите один миллилитр 40%-ной уксусной кислоты в CN 0,5%-ной уксусной кислоты со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту. Затем добавьте один миллилитр 80%a CN 0,5% уксусной кислоты с помощью пятимиллилитрового шприца по желанию. Смешайте в соотношении один к одному тяжелые и легкие меченые образцы пептидов и количественно определите с помощью масс-спектрометрии, чтобы убедиться, что как мечение, так и легкое мечение были эффективными, фракционируйте пептидную смесь, предварительно нанеся ее на колонку с C 18 ВЭЖХ.

Затем, после использования 5%a CN для промывки колонки в течение пяти минут, используйте градиент от 5 до 35% CN в течение 60 минут, чтобы разбавить пептиды в равных фракциях. В 96-луночном планшете с последующим вводом 90% А CN в течение одной минуты. После дополнительных четырех минут при 90% А CN используйте 5% CN для восстановления равновесия колонны.

Затем соедините фракции следующим образом с помощью вакуумной центрифуги. Удалите растворитель из объединенных фракций. Затем используйте 130 микролитров одного моляра мочевины 0,5% TFA для Resus.

Суспензируйте пептиды из следующих фракций и храните набор фракций при температуре минус 20 градусов Цельсия для проведения, остановки и экстракции на ресуспендированных фракциях. Подготовьте микроколонки C 18 stage tip из 200 микролитровых наконечников для пипеток, используя для их упаковки два диска C 18 с внутренним диаметром 1,07 мм. Поместите наконечники ступени в микроцентрифужные пробирки, добавьте 130 микролитров метанола и отжим.

Затем добавьте 130 микролитров 80% CN 0,5% уксусной кислоты перед повторным вращением после использования 130 микролитров 0,1% TFA для балансировки кончиков, перенесите пептидную смесь на кончики и промойте. Сначала 130 микролитров 0,1% ТЖК, а затем 40 микролитров 0,1% ТЖК. Затем 40 микролитров 0,5%-ной уксусной кислоты для элюирования пептидов.

Сначала добавьте 20 микролитров 40% к CN 0,5% уксусной кислоты. Затем 20 микролитров 80%а CN 0,5% уксусной кислоты. Объедините ЭОП и вакуумный фильтрат для высыхания для проведения микрокапиллярной жидкостной хроматографии.

Тандемная масс-спектрометрия или L-C-M-S-M-S начинается с использования 5% муравьиной кислоты, 5% A CN для ресуспендирования белков до концентрации примерно один микрограмм на микролитр. Нанесите примерно один микрограмм пептидов на 100 микрометров на 20 сантиметров C 18. Колонку ВЭЖХ в обратной фазе и элюирование с использованием градиента от 6 до 22% CN в 0,1 25% муравьиной кислоты со скоростью потока приблизительно 300 нанолитров в минуту, применяемую в течение 75-100 минут.

Используйте масс-спектрометр с высоким разрешением и высокой точностью по массе и идентифицируйте пептиды в образце, сравнивая Ms.Ms исходные файлы Spectra с теоретической базой данных с помощью алгоритма, такого как SE quest, используя показанные здесь параметры с базой данных открытых кадров считывания в фактической и обратной ориентациях, отфильтруйте пептиды с вероятностью ложного обнаружения 1% с помощью метода, такого как целевая приманка. Для количественной оценки идентифицированных пептидов рассчитали площади тяжелых и легких пар MS One выделенных ионных хроматограмм и пептидных отношений сигнал/шум включают пептидные пары только в том случае, если их среднее отношение сигнал/шум превышает пять. Количественно оцените относительную распространенность пептида в двух образцах как отношение MS к одному пику тяжелых и легких версий одного и того же пептида, рассчитайте относительную распространенность белка как медианное отношение MS к одной пиковой площади для всех пептидов в белке при фильтрации до 1% коэффициента ложного открытия пептида.

Эффективность готового мечения смеси c фитофермента из тяжелых и легких меченых культур, содержащих 11 194 уникальных пептидных последовательности, составила 98%. Различия в экспрессии белков воспроизводимо отражают соотношения, при которых тяжелые и легкие образцы смешивались в широком диапазоне соотношений смешивания. В частности, изменение 99% белков было меньше 1,6 для смешанных образцов один к одному в образцах от одного к 10 и 10 к одному.

99% белков находились в пределах 3,8 раза от ожидаемого соотношения, демонстрируя увеличение стандартного отклонения на большем расстоянии от смеси один к одному. Когда готовое мечение было нанесено на протеом фитофермента Clostridium, было количественно определено более 2000 белков, причем 94% белков были измерены в двукратных уровнях для репликатных культур, растущих на основе глюкозного белка. Изменения для дубликатов пар культур также были сильно коррелированы.

В совокупности эти эксперименты подтверждают, что протеомика Ready является точным и воспроизводимым методом количественной оценки различий в экспрессии белков между сложными образцами. Поскольку этот метод может быть применен практически к любому типу образцов, он проложил путь исследователям в области протеомики к изучению изменений экспрессии протов во всех видах образцов, включая новые микробы, клетки рыб и млекопитающих.