Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Общая цель данной процедуры — сравнить концентрации множества белков в различных образцах методом масс-спектрометрии с использованием системы ready proteomics. Для этого сначала проводится переваривание белков в каждом образце для получения пептидных смесей. Затем два образца смешиваются, после чего пептиды в смешанном образце фракционируют и обессоливают.

Затем смешанный образец анализируют с помощью масс-спектрометрии. В завершение пептиды идентифицируют путем сравнения масс-спектров второго порядка со стандартной базой данных (target decoy database), содержащей все потенциальные пептиды в образцах, и количественно определяют относительное содержание пептидов в разных образцах. В конечном итоге метод ready proteomics позволяет количественно определить относительное содержание множества белков в сложных образцах.

Основным преимуществом восстановительного деметилирования по сравнению с другими методами изотопного мечения, такими как iLite, является то, что данный подход представляет собой быстрый, недорогой и точный метод, не требующий специальных условий или синтетической среды, что позволяет применять его практически к любому типу образцов. Для начала подготовьте 1 mg клеточного белка и 500 µL раствора, используя соникацию или французский пресс для лизиса клеток с последующим осаждением белков. Добавьте один объем трихлоруксусной кислоты к четырем объемам белка и выдержите на льду в течение 10 минут.

Центрифугируйте при 12,000 Gs в течение пяти минут при температуре four °C и удалите супернатант. Затем используйте 1 mL ледяного ацетона, чтобы ресуспендировать осадок перед повторным центрифугированием.

После аспирации супернатанта высушите осадок в термоблоке при 56 °C для денатурации белков и восстановления дисульфидных связей красителя. Для ресуспендирования используйте 500 µL денатурирующего и восстанавливающего буфера. Ресуспендируйте белки до концентрации приблизительно 2 mg/mL.

Инкубируйте белки в течение 30 минут при 56 °C, затем в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, для алкилирования свободных сульфгидрильных групп, добавьте 25 µL свежеприготовленного 0.3 M раствора иодоацетамида (IAM) в воде к 500 µL белка и инкубируйте в темноте в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации остановите реакцию, добавив 10 µL 3 mM DTT.

Храните алкилированные белки при температуре -80 °C. Для переваривания алкилированных белков после осаждения ТСА используйте 1 M мочевину в 50 mM HEPES (pH 8,2) для ресуспендирования белка. Приготовьте стоковый раствор Lys-C эндопротеиназы в воде с концентрацией 2 мкг/мкл и добавьте фермент к перевариваемому белку до конечной концентрации 10 нг/мкл; образцы выдерживают при комнатной температуре в течение шести часов или в течение ночи. Растворите 20 мкг трипсина секвениронной степени очистки в 40 мкл 50 mM уксусной кислоты и добавьте 5 мкл этого раствора в реакционную смесь для переваривания Lys-C.

Инкубируйте алкилированные белки в течение шести часов при 37 °C. Добавьте трифторуксусную кислоту (TFA) до конечной концентрации 0.5%. Установите колонку C 18 в экстракционный манифольд. Затем используйте 6 mL ацетонитрила (ACN) для увлажнения колонки.

Затем при максимально возможной скорости потока используйте 6 мл 80% CN 0.1% TFA для промывки колонки, после чего используйте 6 мл 0.1% TFA для уравновешивания колонки; остановите вакуумное давление и нанесите 500 мкг пептидов на колонку при скорости потока примерно 1 мл в минуту. Как только пептиды свяжутся с колонкой, снова включите вакуум и при максимально возможной скорости потока используйте 0.1% TFA, а затем 3 мл цитратного буфера для промывки колонки с целью проведения онко-восстановительного диметилирования или готового маркирования. В вытяжном шкафу приготовьте по 12 мл легкого и тяжелого готовых буферов для метилирования свободных пептидов.

Добавьте в колонку 10 мл либо легкого, либо тяжелого готового буфера со скоростью потока 1 мл/мин. После внесения второй аликвоты объемом 10 мл, для обеспечения маркировки используйте 6 мл 0,1% TFA, затем 1 мл 0,5% уксусной кислоты.

Для промывки колонки с целью элюирования белков прекратите вакуумирование и нанесите 1 mL 40% ацетонитрила с 0,5% уксусной кислоты со скоростью потока 0,5 mL/мин. Затем добавьте 1 mL 80% ацетонитрила с 0,5% уксусной кислоты; при необходимости проведите элюирование с помощью шприца объемом 5 mL. Смешайте образцы пептидов с тяжелой и легкой метками в соотношении один к одному и определите их количество методом масс-спектрометрии, чтобы убедиться в эффективности как тяжелого, так и легкого мечения; затем фракционируйте смесь пептидов, предварительно нанеся её на ВЭЖХ-колонку C 18.

Затем, после промывки колонки 5%a CN в течение пяти минут, используйте градиент от 5 до 35%a CN в течение 60 минут для элюции пептидов в равные фракции в 96-луночный планшет, после чего подайте 90%A CN в течение одной минуты. После дополнительных четырех минут подачи 90%A CN используйте 5%a CN для повторного уравновешивания колонки.

Затем объедините фракции следующим образом с помощью вакуум-центрифуги. Удалите растворитель из объединенных фракций. Затем используйте 130 µL 1 M мочевины в 0.5% TFA для ресуспендирования.

Ресуспендируйте пептиды из следующих фракций и храните набор фракций при температуре -20 °C для проведения экстракции по методу «stop-and-go» ресуспендированных фракций. Изготовьте микроколонки-StageTip C 18 из наконечников для дозатора объемом 200 µL, используя два диска C 18 с внутренним диаметром 1,07 мм для их заполнения. Поместите StageTip в микроцентрифужные пробирки, добавьте 130 µL метанола и центрифугируйте.

Затем добавьте 130 µL 80% CN 0,5% уксусной кислоты перед повторным центрифугированием; после этого, используя 130 µL 0,1% TFA для уравновешивания наконечников, перенесите смесь пептидов в наконечники и проведите промывку. Сначала используйте 130 µL 0,1% TFA, затем 40 µL 0,1% TFA. В завершение добавьте 40 µL 0,5% уксусной кислоты для элюции пептидов.

Сначала добавьте 20 µL 40% CN в 0,5% уксусную кислоту. Затем добавьте 20 µL 80% CN в 0,5% уксусную кислоту. Объедините полученные растворы и профильтруйте под вакуумом досуха для проведения микрокапиллярной жидкостной хроматографии.

Тандемная масс-спектрометрия или L-C-M-S-M-S начинается с ресуспендирования белков в 5% formic acid и 5% A CN до концентрации приблизительно 1 µg/µL. Примерно 1 µg пептидов наносят на обращенно-фазовую колонку HPLC C 18 размером 100 µm × 20 cm и элюируют, используя градиент A CN от 6% до 22% в 0.1 25% formic acid при скорости потока приблизительно 300 nL/min в течение 75–100 минут.

Используйте масс-спектрометр с высоким разрешением и высокой точностью определения массы; идентифицируйте пептиды в образце путем сравнения исходных файлов Ms.Ms спектров с теоретической базой данных с помощью такого алгоритма, как SEquest, используя приведенные здесь параметры и базу данных открытых рамок считывания в прямой и обратной ориентациях; отфильтруйте пептиды до уровня ложноположительных результатов (FDR) 1% с помощью такого метода, как target-decoy. Для количественного определения идентифицированных пептидов рассчитайте площади пиков экстрагированных ионных хроматограмм MS1 для тяжелых и легких пар, а также отношение сигнал/шум для пептидов; включайте пары пептидов только в том случае, если их среднее отношение сигнал/шум превышает пять. Определите относительное содержание пептида в двух образцах как отношение площадей пиков MS1 тяжелой и легкой версий одного и того же пептида; рассчитайте относительное содержание белков как медианное отношение площадей пиков MS1 для всех пептидов данного белка при фильтрации по уровню ложноположительных результатов для пептидов 1%.

Эффективность мечения смеси фермента c phyto из культур с тяжелыми и легкими изотопами, содержащей 11 194 уникальных пептидных последовательности, составила 98%. Аналогичным образом был проанализирован нефракционированный лизат белков visier. Различия в экспрессии белков воспроизводимо отражают соотношения, в которых смешивались тяжелые и легкие образцы, в широком диапазоне соотношений смешивания. В частности, изменение уровня 99% белков было менее 1,6 для образцов, смешанных в соотношении один к одному, один к десяти и десять к одному.

99% белков находились в пределах 3,8-кратного отклонения от ожидаемого соотношения, что указывает на увеличение стандартного отклонения при большем удалении от смеси в соотношении один к одному. При применении метода ready labeling к протеому фермента Clostridium phyto было количественно определено более 2000 белков, при этом 94% белков были измерены с двукратным уровнем точности для повторных культур, выращенных на глюкозном белковом субстрате. Изменения для пар дубликатов культур также были высококоррелированы.

В совокупности эти эксперименты подтверждают, что метод Ready proteomics является точным и воспроизводимым способом количественного определения различий в экспрессии белков в сложных образцах. Поскольку эта методика может быть применена практически к любому типу образца, она открыла исследователям в области протеомики путь к изучению изменений экспрессии белков в самых разных образцах, включая новые микробы, клетки рыб и млекопитающих.