Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

Общая цель данного усовершенствованного мультиплексного метода заключается в увеличении количества белковых образцов, которые можно анализировать одновременно, при одновременном снижении погрешности анализа и времени работы прибора. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, нейродегенеративных заболеваний, других возрастных заболеваний и рака, касающиеся патогенеза, прогрессирования, диагностики, прогноза и терапевтических мишеней. Основным преимуществом данной методики является возможность получения комплексного представления об изменениях белков при множестве различных условий.

Хотя данный метод позволяет получить представление о болезни Альцгеймера на мышиной модели, он также может быть применен к образцам тканей пациентов с болезнью Альцгеймера или рядом других расстройств. Как правило, лицам, впервые осваивающим этот метод, он может показаться сложным, поскольку в короткие временные интервалы необходимо одновременно обрабатывать несколько образцов. Идея этого метода возникла у нас, когда мы осознали, что ацетилирование можно сочетать с изобарическим мечением для нитрации белков, что побудило нас адаптировать эту методику для глобального применения ко всем пептидам.

В данном исследовании будет проведен анализ тканей головного мозга, сердца и печени мышиной модели болезни Альцгеймера и контрольной группы дикого типа. Перенесите от 60 до 90 mg каждого образца ткани в пробирку для лизиса и добавьте 500 µL PBS с 8 M мочевиной. Гомогенизируйте образцы с помощью механического гомогенизатора.

Извлеките гомогенат ткани из пробирки для лизиса и перенесите его в микроцентрифужную пробирку. Промойте пробирку для лизиса 100–500 µL PBS с 8 M мочевиной и объедините промывочный раствор с гомогенатом ткани. Центрифугируйте гомогенат ткани в течение 15 минут.

Соберите супернатант из каждого образца. После проведения BCA-анализа для определения концентрации белка перенесите 100 µg белка из каждого образца в отдельные промаркированные микроцентрифужные пробирки. Добавьте в каждый образец дитиотреитол.

Затем инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. Добавьте иодацетамид (IAM) в каждый образец и инкубируйте на льду в темноте в течение двух часов. Далее добавьте L-цистеин в каждый образец и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Через 30 минут добавьте Трис-буфер с хлоридом кальция, чтобы развести мочевину до конечной концентрации 2 M. В каждый образец добавьте трипсин, обработанный L1-тосил-лимотитофенилэтилхлорметилкетоном. Инкубируйте при 37 °C в течение 24 часов.

На следующий день остановите протеолиз путем мгновенной заморозки образца в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до дальнейшей обработки. Перед диметилированием образцы пептидов подвергают обессоливанию, как описано в текстовом протоколе, и высушивают с помощью вакуум-центрифугирования. Для начала процедуры диметилирования реконструируйте пептиды в 1% уксусной кислоте, растворенной в воде сорта HPLC или nanopure.

Перенесите порцию каждого образца массой 50 µg в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL. Остаток реконструированных пептидов храните при температуре -80 °C для последующих экспериментов. В следующих демонстрируемых этапах крайне важно быстро добавлять реагенты, чтобы химические реакции активации протекали в течение одного и того же времени для всех образцов.

Добавьте 8 µL 60 мМ раствора формальдегида в образцы для легкого диметилирования. Добавьте 8 µL 60 мМ раствора формальдегида, меченного изотопами углерода 13 и дейтерия, в образцы для тяжелого диметилирования. Добавьте 8 µL 24 мМ цианоборогидрида натрия в образцы, прошедшие легкое диметилирование.

Добавьте 8 µL 24 мМ цианоборогидрида натрия в образцы, помеченные тяжелым диметилированием. Перемешайте образцы на вортексе, затем осторожно встряхивайте на шейкере для пробирок в течение примерно 10 минут при комнатной температуре. Остановите реакции, добавив 16 µL 1% аммиака, и выдержите в течение пяти минут.

Повторно подкислите реакционные смеси, добавив 8 µL 5% муравьиной кислоты. Объедините легко- и тяжело-диметилированные пептиды, чтобы получить в общей сложности шесть образцов. Проведите обессоливание образцов согласно текстовому протоколу.

Высушите образцы с помощью вакуум-центрифугирования. Для проведения изобарического мечения диметилированных образцов сначала реконституируйте 100 µg диметилированных пептидов в буфере триэтиламмонийбикарбоната (TEAB). Затем подготовьте изобарические реагенты в соответствии с протоколом производителя набора для изобарического мечения.

Добавьте соответствующий объем, в данном случае 41 µL растворенного реагента для изобарного мечения, в каждый из образцов пептидов и перемешайте на вортексе в течение примерно 10 секунд. Инкубируйте образцы на шейкере для микроцентрифужных пробирок в течение примерно одного часа при комнатной температуре. Для остановки реакций добавьте по 8 µL гидроксиламина в каждый образец.

Инкубируйте образцы в течение 15 минут при комнатной температуре. Объедините шесть маркированных образцов в одну смесь и проведите обессоливание. Подготовьте пептиды для жидкостной хроматографии, восстановив их в воде масс-спектрометрического качества с 0.1% formic acid.

Добавьте реконструированные пептиды в микроцентрифужную пробирку с фильтром 0,65 мкм. Центрифугируйте при 12 000 ×g в течение одной минуты. Извлеките и утилизируйте фильтр.

Перенесите отфильтрованные пептиды в виалу автосамплера. Введите по 6 µL каждой фракции образца после сильного катионообменного разделения на колонку-ловушку. Набейте ее материалом C18 на длину 2 cm.

Запустите методы аналитического разделения и сбора данных на масс-спектрометре. Был проведен 12-плексный анализ cPilot тканей мозга, сердца и печени мышиной модели болезни Альцгеймера и контрольной группы дикого типа. Данные по предшественникам показали наличие легких и тяжелых диметилированных пептидов, представленных пиками с m/z 643.854 и 647.875.

Данные пептиды были отобраны, независимо изолированы и фрагментированы с помощью диссоциации, индуцированной столкновениями, для получения этих спектров. Результаты поиска показали, что пики принадлежат пептиду белка фосфоглицераткиназы 1. Эти пики были дополнительно изолированы для тандемной масс-спектрометрии с диссоциацией при более высокой энергии столкновений, в результате чего наблюдались репортерные ионы, как показано на рисунке.

Для получения информации о 12 образцах необходимы оба набора спектров масс-спектрометрии в три стадии. В данном примере соотношения ионов при сравнении болезни Альцгеймера с контролем дикого типа схожи для двух биологических повторов в тканях мозга, печени и сердца. Значения кратности изменения (fold change) для каждого сравнения позволяют предположить, что уровни фосфоглицераткиназы 1 в мозге и сердце выше у мышей с болезнью Альцгеймера, но ниже в печени.

После освоения эта методика может быть выполнена примерно за пять часов при условии правильного соблюдения протокола. При проведении данной процедуры важно соблюдать осторожность при работе с образцами. В данный процесс могут быть включены такие методы разделения, как сильный катионообмен или фракционирование при высоком pH, для увеличения глубины и охвата анализа за один день.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как улучшить мультиплексирование образцов с помощью C-Pilot.