Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

Общая цель этого усовершенствованного мультиплексного метода заключается в увеличении количества образцов белка, которые могут быть проанализированы одновременно, при одновременном снижении ошибки выборки и времени работы прибора. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, нейродегенеративных заболеваний, других возрастных заболеваний и рака, которые связаны с патогенезом, прогрессированием, диагностикой, прогнозом и терапевтическими целями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно получить всестороннюю картину изменений белка во многих условиях.

Хотя этот метод может дать представление о болезни Альцгеймера на мышиной модели, он также может быть применен к образцам тканей пациента с болезнью Альцгеймера или рядом других заболеваний. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, найдут его сложным, потому что необходимо одновременно обрабатывать несколько образцов за короткий промежуток времени. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что ацетилирование можно сочетать с изоберическим мечением для нитрования белка, что побудило нас сделать этот метод глобальным для всех пептидов.

В этом исследовании будут проанализированы ткани мозга, сердца и печени на мышиной модели с болезнью Альцгеймера и контрольной группы дикого типа. Перенесите от 60 до 90 миллиграммов каждого образца ткани в лизирующую пробирку и добавьте 500 микролитров PBS с восемью молярами мочевины. Гомогенизируйте образцы с помощью механического гомогенизатора.

Извлеките гомогенат ткани из пробирки для лизиса и переложите в микроцентрифужную пробирку. Промойте лизирующую трубку от 100 до 500 микролитров PBS с восемью молярами мочевины и соедините раствор для полоскания с гомогенатом ткани. Центрифугируйте гомогенат тканей в течение 15 минут.

Выхватите надосадочную жидкость из каждого образца. После проведения анализа БЦА для определения концентрации белка добавьте 100 мкг белка из каждого образца в индивидуально маркированные микроцентрифужные пробирки. Добавляйте дитиотреитол в каждый образец.

И инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Добавьте в каждый образец йодоацетамид, IAM, и инкубируйте на льду в темноте в течение двух часов. Далее добавьте L-цистеин в каждый образец, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Через 30 минут добавьте трис-буфер с хлоридом кальция, чтобы разбавить мочевину до конечной концентрации в два моляра. Добавьте L1 тозилимитотофенилэтилхолер метилкетонированный трипсин в каждый образец. И инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день утолите расщепление белка путем мгновенной заморозки образца в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. Перед мечением диметилированием образцы пептидов обессоливают, как описано в текстовом протоколе, и высушивают методом вакуумного центрифугирования. Чтобы начать процедуру мечения диметилированием, восстановите пептиды в 1%-ной уксусной кислоте, растворенной в ВЭЖХ или воде с наночистым качеством.

Удалите порцию в 50 микрограммов каждого образца в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Храните оставшиеся восстановленные пептиды при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущих экспериментов. На этапах, которые будут продемонстрированы далее, крайне важно быстро добавить реагенты, чтобы химические реакции протекали в течение одинакового времени для всех образцов.

Добавьте восемь микролитров 60 миллимолярного раствора формальдегида в образцы для мечения легким диметилированием. Добавьте восемь микролитров 60 миллимолярного раствора формальдегида, меченного углеродом 13 дейтерием, в образцы для мечения с сильным диметилированием. Добавьте восемь микролитров цианоборогидрида натрия 24 миллимоляра в образцы, помеченные легким диметилированием.

Добавьте восемь микролитров цианобородудерида натрия 24 миллимола в образцы, меченные сильным диметилированием. Сделайте образцы вихревыми, а затем осторожно встряхните на пробирке в течение примерно 10 минут при комнатной температуре. Угасите реакции, добавив 16 микролитров 1%-ного аммиака на пять минут.

Повторно подкислите реакционные смеси, добавив восемь микролитров 5%-ной муравьиной кислоты. Объедините легкие и тяжелые диметилированные пептиды, чтобы получить в общей сложности шесть образцов. Выполните обессоливание образцов, как описано в текстовом протоколе.

И высушите образцы методом вакуумного центрифугирования. Для изобарического мечения диметилированных образцов сначала восстанавливают 100 мкг диметилированных пептидов и бикарбоната триэтиламмония, или TEAB-буфера. Далее готовят изобарические реагенты в соответствии с протоколом производителя набора для изобарического мечения.

Добавьте соответствующий объем, в данном случае 41 микролитр солюбилизированного изобарического мечающего реактива к каждому из пептидных образцов, и переведите вихрь около 10 секунд. Встряхните образцы на микроцентрифужной пробирке в течение примерно одного часа при комнатной температуре. Чтобы погасить реакции, добавьте в каждый образец по 8 микролитров гидроксиламина.

И инкубировать образцы в течение 15 минут при комнатной температуре. Объедините шесть меченых образцов в одну смесь и обессольте. Подготовьте пептиды для жидкой хроматогрофии путем восстановления пептидов в воде масс-спектрометрического класса с 0,1% муравьиной кислотой.

Добавьте восстановленные пептиды в микроцентрифужную пробирку, содержащую фильтр 0,65 микрометра. И центрифугировать при 12 000 раз g в течение одной минуты. Снимите и выбросьте фильтр.

Перенесите отфильтрованные пептиды во флакон с автосэмплером. Внесите по шесть микролитров каждого образца сильной катионообменной фракции в ловушку-колонку. Упакуйте до двух сантиметров материалом из углерода 18.

Запустите методы аналитического разделения и сбора данных масс-спектрометра. Был проведен 12-плексный анализ тканей мозга, сердца и печени cPilot на мышиной модели болезни Альцгеймера и контрольной группы дикого типа. Данные по предшественникам показали легкие и тяжелые диметилированные пептиды, представленные пиками на m/z 643,854 и 647,875.

Эти пептиды были отобраны, изолированы независимо друг от друга и фрагментированы с помощью диссоциации, вызванной сговором, для получения этих спектров. Результаты поиска показали, что пики принадлежали пептиду протеинфосфоглицераткиназы. Эти пики были выделены далее для тандемной масс-спектрометрии с более высокоэнергетическим сговором диссоциации, и репортерные ионы наблюдались, как показано на рисунке.

Оба набора трехступенчатых масс-спектрометрических спектрометрических спектров необходимы для получения информации о 12 образцах. В этом примере соотношение ионов при болезни Альцгеймера и контроле дикого типа аналогично для двух биологических репликатов тканей мозга, печени и сердца. Значения кратного изменения для каждого сравнения свидетельствуют о том, что уровни фосфоглераткиназы 1 в мозге и сердце выше у мышей с болезнью Альцгеймера, но ниже в печени.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о осторожности при обращении с образцом. В рамках этой процедуры можно использовать такие методы разделения, как сильный катионный обмен или фракционирование с высоким pH, для увеличения глубины и охвата суточных.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как улучшить мультиплексирование образцов с помощью C-Pilot.