Анализ бислоя липидов с планарной поддержкой: метод in vitro на основе микроскопии для исследования сборки септина на биологических мембранных мимиках

Септины представляют собой цитоскелетные белки, содержащие ГТФ-связывающий домен, окруженный концевыми амино- и карбоксильными доменами, с присущей им способностью самособираться в филаменты и структуры более высокого порядка на внутренней плазматической мембране для выполнения различных клеточных функций.

Для изучения септиново-мембранных взаимодействий in vitro с помощью биологической мембранной имитации получают разрезанную микроцентрифужную пробирку. Нанесите ультрафиолетовый клей на неразрезанный плоский ободок и расположите его на обработанном плазмой гидрофилизированном стеклянном покровном стекле. Под воздействием ультрафиолета клей отверждается, создавая открытую реакционную камеру.

Перенос в камеру монодисперсных цвиттерионных униламеллярных липидных везикул нужного липидного состава, дополненных моно- и двухвалентным катионсодержащим буфером. Катионы способствуют адсорбции липидных пузырьков и накоплению на покровном стекле. Аккуратно встряхните камеру, инициировав разрыв пузырьков, и высиживайте.

Разорванные везикулы разворачиваются и сливаются с покровным стеклом через свои гидрофильные головные группы, образуя планарные липидные бислойные участки. Края участков вызывают разрыв оставшихся везикул, создавая непрерывный липидный бислой, поддерживаемый планарами, SLB. Удалите излишки неадсорбированных пузырьков с помощью подходящего буфера.

Затем добавьте меченую флуоресцентно меченую суспензию септина с буфером, содержащим краудагент, и инкубируйте. Реагенты для скученности позволяют септинам оседать на покровном листе с покрытием SLB. В оптимальных условиях септины могут связываться с липидами в SLB, собираясь в организованные структуры.

Выборочно освещайте покровное стекло с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением, чтобы возбудить прилипшие флуоресцентно меченные септины на SLB для наблюдения за сборкой септина.

Чтобы начать плазменную очистку салазок, продуйте плазмоочиститель в течение 5 минут кислородом, чтобы удалить воздух из трубопроводов и камеры. Разложите сухие покровные стекла в керамическую колыбель. Во время продувки направляйте инертный газ на предметные стекла микрозащитного стекла, чтобы удалить пыль и твердые частицы.

Поместите опору в задней части плазменной камеры так, чтобы покровные стекла были параллельны длинному краю камеры. Запустите плазменный очиститель в течение 15 минут с кислородом на максимальной мощности.

Для подготовки камеры срежьте колпачок чуть ниже матовой части 0,2-миллилитровой ПЦР-пробирки. Покрасьте край ПЦР-пробирки УФ-активированным клеем, избегая внутренней части пробирки. Аккуратно поместите приклеенную пробирку ПЦР в центр очищенного плазмой покровного стекла, затем поместите камеру под длинноволновое ультрафиолетовое излучение на 5-7 минут, чтобы клей затвердел.

Чтобы сформировать бислой, добавьте реагенты в лунку. Осторожно встряхивайте камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

После инкубации промыть бислой 6 раз 150 микролитрами SLBB, с помощью пипетки смыть излишки липидов. Затем промойте бислой 6 раз 150 микролитрами реакционного буфера перед инкубацией с септинами.

На последнем этапе промывки удалите реакционный буфер, оставив в лунке 75 микролитров. Добавьте 25 микролитров септинов, разведенных в SSB, и получите изображение с помощью микроскопии TIRF.