Guided Скрининг Материалы подхода к разработке количественных полученных золь-гель Microarrays Белки

Общая цель данной процедуры заключается в поиске новых материалов на основе золь-гель процессов для изготовления микрочипов и их последующем использовании в ферментативных анализах с нанообъемами. Сначала определяются материалы с достаточно длительным временем гелеобразования, чтобы избежать застывания геля в иглах принтера микрочипов в процессе печати. На втором этапе материалы с длительным временем гелеобразования оцениваются по их способности к воспроизводимой печати в виде микрочипов, устойчивости к растрескиванию, качеству адгезии, отсутствию нежелательного фазового разделения и, в конечном итоге, по высокой активности инкапсулированных ферментов.

Затем исследуемый фермент наносится в виде микрочипа с использованием оптимальных материалов, после чего проверяется способность этого чипа удерживать рабочий раствор анализа и генерировать измеримый ферментативный ответ. Заключительным этапом является оценка материалов по их способности обеспечивать высокую воспроизводимость анализов с использованием исследуемого фермента и получение количественных данных. На основании этого выбирается окончательный материал для изготовления чипа.

В конечном итоге белковые микрочипы на основе золь-гель матрицы используются для идентификации малых молекул, снижающих активность ферментов. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как скрининг в планшетах, является возможность очень быстрого и систематического скрининга большого количества материалов с использованием малых объемов реагентов. Как правило, специалисты, впервые применяющие эту методику, сталкиваются с трудностями из-за возможного гелеобразования материалов внутри печатающих пинов.

Если их после этого очистить неправильно, останутся пропуски, которые могут быть ошибочно приняты за непечатные материалы. Для начала приготовьте необходимые растворы добавок согласно описанию в сопроводительном текстовом протоколе. Многие растворы можно приготовить заранее и хранить до одного месяца или дольше при соблюдении соответствующих условий, однако некоторые из них должны быть приготовлены в день проведения эксперимента.

Смешайте составы на основе силиката натрия непосредственно перед использованием и обязательно храните их на льду. SOS необходимо использовать в течение одного часа после добавления воды, так как более длительное ожидание приводит к сокращению и нестабильности времени DATION. Затем подготовьте различные комбинации буферов, полимерных растворов и органогелей, как указано в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы определить, какие комбинации могут быть использованы в качестве материалов для печати со временем дилатансии более 2.5 hours.

После определения ряда комбинаций установите влажность в камере принтера на уровень от 80 до 90%. Влажность ниже 80% может привести к испарению образцов и неоднородности печати из-за малых объемов осаждения, используемых в принтере. После подготовки настройте шаблоны массивов для печати с помощью программы Chip Writer Pro. Установите скорость перемещения в направлении XY на 10 мм/с, а скорость приближения к образцу в направлении Z — на 2 мм/с с временем загрузки образца 2,5 с, используя ранее определенные комбинации гидрогелей.

Приготовьте 25 µL базовых материалов, смешав соответствующие полимеры, органоланы и низкомолекулярные добавки, определенные в процессе предварительного скрининга. Внесите 50 mM HEPES с pH 8,0 в отдельные лунки микротитрационного планшета на 384 лунки. Затем подвергните ультразвуковой обработке до четырех прорезанных фиксирующих штифтов диаметром 100 micron в дважды дистиллированной воде.

Через 15 минут просушите их потоком азота. Затем с помощью ершика удалите остатки влаги изнутри держателя пина и осторожно установите пин в печатную головку робота для печати контактными пинами. Неудаление остаточной влаги может помешать свободному перемещению пина в держателе, что приведет к появлению пропусков при печати.

Затем, непосредственно перед печатью, добавьте в лунку 25 µL соответствующего SA. Перемешайте раствор, 50 раз перемещая поршень пипетки вверх и вниз. Старайтесь минимизировать количество воздуха, попадающего в раствор.

Пузырьки воздуха препятствуют полному заполнению пина образцом. Затем заполните пин, погрузив его в образец. После заполнения пинов начните процесс печати и нанесите образец на поверхность одного предметного стекла.

Приостановите процесс печати перед добавлением соли в следующую исходную планшетку. При приостановленном процессе извлеките иголку принтера с помощью магнита и вставьте в печатающую головку ершик, чтобы предотвратить накопление влаги. Затем промойте иголку принтера дважды дистиллированной водой и обработайте ее в ультразвуковой ванне с чистой дважды дистиллированной водой в течение 30 секунд.

Затем высушите печатный штифт струей азота и установите его обратно в печатающую головку. Продолжайте перемешивание, печать и очистку для всех оставшихся образцов в исходном планшете; на одном предметном стекле можно нанести до 12 000 пятен диаметром 100 мкм. После завершения печати выдержите массив в течение минимум 30 минут и не более 24 часов в печатной камере при влажности от 80 до 90%.

Непосредственно перед использованием приготовьте 50 µL положительного контроля, смешав в лунке 384-луночного микротитрационного планшета 25 µL 1 mM йодида ацетилхолина и 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL цистеина и 25 mM Трис (pH 7.0) с 4% глицерином; медленно пропипетируйте раствор вверх-вниз для перемешивания, чтобы не образовались пузырьки. Затем непосредственно перед использованием приготовьте отрицательные контроли, добавив 0,14 µL 5 mM BODIPY-FL цистеина к 49,86 µL 25 mM Трис (pH 7.0) с 4% глицерином в другую лунку 384-луночного микротитрационного планшета и осторожно перемешайте их. Нанесите контроли на состаренные микрочипы, используя те же процессы, которые были описаны в предыдущем разделе. Однако вместо пинов диаметром 100 мкм используйте сменные пины диаметром 235 мкм.

Это гарантирует, что растворы полностью покрывают ранее нанесенные пятна. Пятна выдерживают в массивах при влажности 80–90% в течение одного часа при комнатной температуре, что способствует автогидролизу ацетилхолина. Более длительная инкубация может привести к ложноположительным результатам из-за повышенной активности фермента.

Убедитесь, что сканер микрочипов Alpha Innotech Novo Array Imager включен и оснащен фильтром возбуждения 478 ± 17 нм и фильтром эмиссии 538 ± 21 нм для измерения микрочипов ацетилхолинэстеразы. Затем поместите предметное стекло в держатель пятнами вверх. Установите количество сечений предварительного просмотра таким образом, чтобы с каждой стороны предметного стекла был доступен просмотр как минимум одного участка с минимальным разрешением 4 мкм с использованием функции автоэкспозиции.

Как только параметры будут признаны приемлемыми, получите изображение слайда и сохраните его в формате TIFF. Затем откройте полученное изображение слайда в программе ImageJ 64. Выберите инструмент овального выделения (Oval Selection Tool) и выделите каждое пятно.

Выберите область, немного превышающую размер наблюдаемого пятна; при этом используйте одинаковый размер для всех пятен, чтобы снизить субъективность анализа в ImageJ. Затем измерьте интенсивность сигнала каждого пятна с помощью опции measure во вкладке analyze. Вычислите среднюю интенсивность для 25 аналогичных пятен положительного контроля и разделите ее на среднюю интенсивность 25 аналогичных пятен отрицательного контроля, чтобы получить соотношение положительного контроля к отрицательному контролю для каждого состава материала.

Здесь приведен пример динамического диапазона полученных микромассивов, подготовленных с помощью этих методов. Высокие контроли дали ярко-зеленые области, в то время как низкие контроли дали гораздо более тусклые пятна. Интенсивность, измеренная с помощью Image J 64, показывает, что среднее значение для высоких контролей составляет около 22 000 относительных флуоресцентных единиц, а для низких контролей среднее значение близко к 8 000.

Пунктирные линии обозначают три стандартных отклонения от среднего значения. Ниже приведены примеры микрочипов для скрининга синтетических аналогов алкалоидов ameral sier, идентифицированных как соединение один и соединение два. Обе оси представляют процент активности фермента, определенный по флуоресцентному сигналу.

Расположение точек вблизи диагонали при проведении анализа в дубликатах свидетельствует о высокой воспроизводимости метода. Здесь представлены графики IC 50 для двух различных потенциальных ингибиторов. Для первого соединения значение IC 50 составило 16 micromolar, тогда как IC 50 второго соединения составило 21 micromolar. Выше показаны репрезентативные пятна, иллюстрирующие различия в сигнале пропорционально концентрациям ингибитора.

Представленный здесь массив был напечатан с использованием четырех различных киназ: P 38 map киназы, EGFR и GSK, и затем поверх него были нанесены буфер без добавок, буфер, содержащий ATP, и буфер, содержащий ATP и стауроспорин — ингибитор ферментативной активности. Результаты, основанные на полученной интенсивности флуоресценции, описанной далее, демонстрируют значительный эффект ингибитора киназы стауроспорина. Наибольшая разница при использованной здесь концентрации стауроспорина наблюдалась в пятнах P 38.

Здесь представлены репрезентативные пятна микрочипа P 30 8:00 AM BP, на который были нанесены различные концентрации сторспорина. Как указано, IC 50 данной молекулы была определена как 1 µM, что показано на графике справа. После освоения эта методика может быть выполнена за несколько часов при условии правильного соблюдения данной процедуры.

Для поиска ответов на дополнительные вопросы, связанные с диагностикой или поиском малых молекул, могут быть также использованы другие методы, такие как иммуноанализы или анализы белковых взаимодействий.