Guided Скрининг Материалы подхода к разработке количественных полученных золь-гель Microarrays Белки

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении новых материалов на основе геля души для изготовления микрочипов и использовании их для анализа нанообъемных ферментов. Это достигается путем предварительного выявления материалов, которые имеют достаточно длительное время созревания, чтобы избежать гелеобразования в печатающем штифте микрочипа в процессе печати. Второй шаг заключается в оценке материалов с длительным временем обработки на предмет их способности печатать в виде микрочипов, воспроизводимости, устойчивости к адгезии при растрескивании, качества, нежелательного разделения фаз и, в конечном итоге, высокой активности захваченных ферментов.

Затем интересующий фермент печатается в виде микрочипа с использованием оптимальных материалов, и его способность обнаруживать раствор для анализа и генерировать измеримый ферментативный ответ. Последним шагом является оценка материалов на предмет их способности обеспечивать высоковоспроизводимые анализы с использованием интересующего фермента и получать количественные данные. Затем выбирается окончательный материал для изготовления массива.

В конечном счете, белковые микрочипы, полученные из геля души, используются для идентификации малых молекул, которые снижают активность ферментов. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как скрининг на основе пластин, заключается в том, что вы можете проводить систематический скрининг большого количества материалов очень быстро и с использованием небольших объемов реагентов. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, испытывают трудности, потому что материалы могут быть гелеобразными внутри печатных штифтов.

Если они затем будут должным образом очищены, это приведет к появлению пропущенных пятен, которые могут быть интерпретированы как материалы, не пригодные для печати. Для начала подготовьте многочисленные решения по присадкам, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Многие из растворов могут быть заранее приготовлены и храниться до одного месяца или дольше при правильных условиях, но некоторые должны быть изготовлены в день эксперимента.

Смешайте пилы на основе силиката натрия непосредственно перед использованием и обязательно держите их на льду. SOS необходимо использовать в течение одного часа после добавления воды, так как более длительные периоды ожидания приводят к сокращению и непостоянному времени DATION. Затем подготовьте различные комбинации буферов, саланов, полимеров и дорожек органов, как указано в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы определить, какие комбинации можно использовать в качестве печатного материала с временем расширения более 2,5 часов.

После того, как будет определен ряд комбинаций, установите влажность в печатной камере на уровне от 80 до 90%, влажность менее 80% может привести к испарению образца и несоответствиям при печати из-за небольших объемов осаждения с принтером. Теперь, когда все готово, расположите массивы массивов, которые будут напечатаны с помощью программы Chip Writer Pro. Установите перемещение в направлении XY равным 10 миллиметрам в секунду, а скорость приближения образца в направлении Z равным двум миллиметрам в секунду со временем загрузки образца 2,5 секунды с использованием комбинаций пильного геля, определенных ранее.

Приготовьте 25 микролитров основных материалов, комбинируя соответствующие полимеры, органополосы и низкомолекулярные добавки, выявленные в процессе предварительного скрининга. Использование 50 миллимолярных куч с pH 8,0 в отдельные лунки 384-луночной микротитровой пластины. Затем обработайте ультразвуком до четырех щелевых штифтов оболочки диаметром 100 мкм в воде двойной дистилляции.

Через 15 минут попробуйте их под струей азота. Затем с помощью очистителя труб удалите остаточную влагу из держателя контактов и осторожно поместите булавку в печатающую головку робота для печати контактных контактов. Если не удалить остатки влаги, штифт может помешать свободному перемещению пальца вместе с держателем, что приведет к пропущенным местам.

Затем добавьте 25 микролитров соответствующего SA в лунку непосредственно перед печатью. Перемешайте раствор с помощью пипетирования вверх и вниз Повторите 50 раз при смешивании пипеткой. Сведите к минимуму количество воздуха, содержащегося в растворе.

Пузырьки воздуха препятствуют полной загрузке образца внутрь штифта. Далее нагружаем штифт, опуская его в образец. После того, как контакты будут загружены, начните процесс печати и распечатайте образец на одной поверхности слайда.

Приостановите процесс печати перед добавлением соли на последующую исходную пластину. Ну, приостановив процесс, снимите печатающий штифт с помощью магнита и поместите очиститель труб в печатающую головку, чтобы предотвратить скопление влаги в печатающей головке. Затем промойте печатный штифт водой двойной дистилляции и обработайте его ультразвуком в чистой воде двойной дистиллированной в течение 30 секунд.

Затем высушите печатный штифт под струей азота, а затем поместите штифт обратно в печатающую головку. Продолжайте смешивание, печать и очистку для всех образцов, оставшихся в пределах исходной пластины, до 12 000 пятен, диаметром 100 микрон могут быть нанесены на одно предметное стекло. После завершения печати состарьте матрицу в течение от 30 минут до 24 часов в печатной камере при влажности от 80 до 90%.

Приготовьте 50 микролитров положительного контроля непосредственно перед использованием, смешав 25 микролитров одного миллимолара, ацетилхолина йодида и 0,14 микролитров пяти миллимоляров боди-пи, цистеина FIL и 25 миллимолярных трисов при pH 7,0 с 4%-ным глицерином в лунке 384-луночной микротитровочной пипетки, медленно поднимайте и уменьшайте раствор, чтобы перемешать без образования пузырьков. Затем приготовьте отрицательные элементы контроля непосредственно перед использованием, соединив 0,14 микролитра пятимиллимолярного цистеина boai PI FIL с 49,86 микролитрами 25 ммиллярного трисса при pH 7,0 с 4% глицерина в другой лунке 384-луночного микротиттера и аккуратно перемешайте их поверх печати контрольной части на старых микрочипах, используя те же процессы, которые описаны в предыдущем разделе. Однако вместо штифтов диаметром 100 микрон вы вставили шлицевые штифты диаметром 235 микрон.

Это гарантирует, что растворы полностью покрывают ранее нанесенные пятна. Пятна старят массивы при влажности от 80 до 90% в течение одного часа при комнатной температуре из-за автогидролиза ацетилхолина. Более длительное время инкубации может привести к ложноположительным результатам из-за повышенной активности ферментов.

Убедитесь, что матричный имиджер alpha innotech novo включен и оснащен фильтром возбуждения 478 плюс-минус 17 нм и эмиссионным фильтром 538 плюс-минус 21 нм для измерения микрочипов ацетилхолинэстеразы. Затем поместите предметное стекло в держатель предметного стекла пятнами вверх. Установите количество секций предварительного просмотра таким образом, чтобы хотя бы один срез с каждой стороны предметного стекла микроскопа просматривался с минимальным разрешением четыре микрометра при использовании автоматической экспозиции.

Как только параметры будут признаны приемлемыми, получите изображение слайда и сохраните его в формате TIFF. Далее откройте полученное изображение слайда на изображении J 64. Кликните на инструменте «Овальное выделение» и выделите каждую точку.

Выберите область, которая немного больше наблюдаемого пятна, и обязательно используйте одинаковый размер между пятнами, чтобы уменьшить субъективность изображения J. Затем измерьте интенсивность сигнала каждого пятна с помощью опции измерения. На вкладке анализ. Усредните интенсивность от 25 одинаковых положительных контрольных точек и разделите на среднюю интенсивность 25 аналогичных отрицательных контрольных точек, чтобы получить положительное отношение контроля к отрицательному контролю для отдельных композиций материала.

Здесь показан пример динамического диапазона полученных микрочипов, полученных с использованием этих методов. Высокий контроль привел к появлению ярко-зеленых областей, в то время как низкий контроль привел к появлению гораздо более тусклых пятен. Интенсивность, измеренная на рисунке J 64, показывает, что высокий контроль составляет в среднем около 22 000 относительных флуоресцентных единиц, а низкий контроль в среднем близок к 8 000.

Пунктирные линии представляют три стандартных отклонения от среднего значения. Ниже приведены примеры микрочипов для скрининга синтетических аналогов алкалоидов амерал-сиер, идентифицированных как соединение 1 и 2. Обе оси представляют процентное содержание фермента, определяемое флуоресцентным сигналом.

В двух экземплярах близость точек к диагонали обеспечивает высокую воспроизводимость анализа. Здесь показаны графики IC 50 двух различных потенциальных ингибиторов. Соединение 1 привело к тому, что уровень IC 50 составил 16 микромоляров, в то время как IC 50 соединения 2 составлял 21 микромоль Репрезентативные пятна показаны выше, чтобы проиллюстрировать различия в сигнале, пропорциональные концентрациям ингибитора.

Показанный здесь массив был напечатан четырьмя различными киназами, P 38 map kinase, EGFR и GSK, и был наложен только буфером, содержащим A TP, и буфером, содержащим A TP и старроспорином, ингибитором активности фермента. Результаты показывают значительный эффект от ингибитора киназы старроспорина на основе результирующей интенсивности флуоресценции, как описано здесь. Наибольшая разница при концентрации используемого здесь спорина была обнаружена в точках P 38.

Здесь показаны репрезентативные пятна микрочипа P 30 8:00 AM BP, которые были покрыты пятнами с различными концентрациями стор спорина. Как указано, IC 50 этой молекулы был определен как один микромоляр и показан на графике справа после освоения. Эту методику можно сделать за несколько часов, если она выполнена правильно после этой процедуры.

Другие методы, такие как иммунологические анализы или анализы взаимодействия белков, также могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, связанные с диагностикой или открытием малых молекул