Протокол биопленки Streamer формирования в микрожидкостных устройств с Micro-столбов

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать формирование бактериальных стримеров в микрофлюидном устройстве с микроколоннами. Это достигается путем предварительного изготовления микрофлюидного чипа. Вторым этапом процедуры является культивирование исследуемых бактерий, в данном случае псевдомонады флуоресценции.

Заключительные шаги заключаются в сборке экспериментальной установки, введении бактерий в микрофлюидный чип и сборе данных. В конечном счете, результаты могут показать эволюцию стримеров во времени с помощью изображений флуоресцентной микроскопии гриппа. Визуальная демонстрация этого металла имеет решающее значение, так как различные этапы трудно освоить.

Из-за междисциплинарного характера эксперимента для этой процедуры требуются кремниевые пластины с глубоким реактивным ионным травлением. Фоторезист на пластинах следует смыть. Начните с бесшумной мастер-формы.

Добавьте две или три капли трихлорэтилена во флакон и поместите его в влагопоглотитель вместе с формой вверх рядом с ним. Через два-три часа плесень будет изолирована. Во время силоизации приготовьте для ПДМС смесь сигар 1 8 4 силиконовой основы с отвердителем в соотношении 10 к одному.

Затем дегазируйте PDMS под вакуумом в течение примерно двух часов. Теперь переложите разрозненную пластину в держатель и полейте ее PDMS, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. Дайте PDMS затвердеть на пластине при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов.

Он изготавливает штамп A-P-D-M-S из силиконовой формы такого размера. Когда отверждение будет завершено, снимите штамп PDMS с помощью резака. Затем разрежьте штамп на микрофлюидный чип с помощью резака.

Теперь с помощью режущего стержня просверлите отверстия на входе и отживании на штампе. Следующим этапом является приклеивание штампа к стеклу. Подвергните 24-миллиметровый защитный колпак и штамп PDMS воздействию кислородной плазмы на 30 секунд.

После экспонирования прикрепите защитный лист к нижней стороне штампа PDMS, и образуется связь. Поместите сборку в духовку при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут. Чтобы завершить процесс для этого протокола, приготовьте планшеты LB, изготовленные из сверхчистой воды и дозированные 50 микрограммами на миллилитр тетрациклина, добавленного при температуре от 50 до 55 градусов Цельсия.

При наливании тарелок пузыри могут лопнуть, если их обжечь. Охлажденные и затвердевшие пластины следует датировать и хранить при температуре четыре градуса Цельсия в фольге. Также есть готовый бульон LB, приготовленный из ультрачистой воды и дозированный 50 микрограмм на миллилитр тетрациклина.

Хранить бульон при температуре четыре градуса Цельсия и также завернуть в фольгу. Теперь культивируемые запасы флуоресценции Pseudomonas хранятся при температуре минус 80 градусов Цельсия на пластинах LB, прорезают пластины зигзагообразно и инкубируют их в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в темноте. На следующий день выберите колонию из тарелки и привите колбу со свежеприготовленным Sone, инкубированным в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия и встряхиванием со скоростью 150 оборотов в минуту.

Измерьте оптическую плотность культуры после инкубации. Затем сделайте решение S два. Добавьте пять миллилитров LB в пластиковую трубку, а затем добавьте достаточное количество раствора S для OD на 600 нанометров 0,1, что характерно для эксперимента с биопленкой.

Для начала постановка эксперимента с помощью пинцета Соедините пластиковые трубки с внутренним диаметром 0,20 дюйма к входным и выходным отверстиям подготовленного чипа. Трубки должны быть гибкими и достаточно длинными. Здесь они составляют около 20 дюймов.

Затем наполните шприцы раствором S two. Прикрепите притупленные иглы 30 калибра и удалите пузыри. Предотвращение попадания пузырьков воздуха в канал является критически важным шагом, особенно из-за длительности эксперимента на линии.

Пузырьки могут повредить мягкие структуры, образованные бактериями. Затем подсоедините шприцы к входным трубкам и подсоедините выпускные трубки к контейнерам для отходов. Теперь поместите шприцы в шприцевой насос и установите насос на желаемую скорость потока, например, восемь микролитров в час на микроскопе, оснащенном камерой для клеток, настроенной на температуру инкубации.

Возможно, используйте объектив с 40-кратным увеличением, чтобы увидеть микрофлюидный чип. Теперь запустите насос. Когда бактерии попадают в камеру, также инициируется образование биопленки.

Биопленка будет формироваться и созревать часами, днями, делать снимки, чтобы отслеживать ее развитие. С помощью SEMA был получен микрофлюидный чип. Вилкообразный вход создан для выравнивания напора давления по всему устройству.

Также видно, что стены колонн расположены почти вертикально. Для исследования образования биопленки в аппарат вводили флуоресценцию со скоростью восемь микролитров в час. Образование биопленки началось через несколько минут после инфузии разведенной бактериальной культуры.

Однако через несколько часов вблизи средней части наблюдалось появление нитевидных структур, простирающихся между микростолбами. Пунктирным эллипсом обозначена формирующаяся стримерная лента, образованная привязанными на одном конце к полюсной области одной из микроколонн. Также были замечены растяжки по диагонали между двумя микростолбами.

Толщина стримеров со временем увеличивалась из-за деления клеток, а также включения планктонных бактерий. Они также разрастались со временем, когда стримеры, занимающие большой объем в устройстве, приводили к образованию зрелой биопленки, которая могла засорить устройство. Механическое моделирование протекания через устройство показывает, что стримеры изначально ориентируются вдоль линий тока жидкости.

Более того, на начальном этапе стримеры возникают в местах с наибольшей скоростью потока. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как формируются и развиваются стримеры биопленки в микрофлюидной среде. Не забывайте, что работа с бактериями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как протоколы биобезопасности.