Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология В Vivo

Общая цель этой процедуры — пометить обонятельные сенсорные нейроны in vivo для визуализации морфологии и развития аксонов. Это достигается путем предварительного порирования фторсодержащего четырехсвязанного декстрана в одиночные обонятельные сенсорные нейроны. Второй шаг — подождать 24 часа, чтобы краситель распространился в аксональные отростки сенсорных нейронов.

Затем головастика обезболивают и с помощью многофотонной микроскопии получают трехмерное изображение обонятельной луковицы. Заключительным этапом является повторное исследование меченого нейрона у одного и того же животного через заданные промежутки времени. В конечном счете, реконструкция клеточной морфологии позволяет визуализировать изменения в морфологии аксонов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как аксоны растут по направлению к целевым областям в переднем мозге и как формируются синапсы. Перед экспериментом. Убедитесь, что установка для электропорации состоит из стереомикроскопа с большим рабочим расстоянием и оснащена флуоресцентным освещением и наборами фильтров для красителя.

Для электропорации используется либо специальная одноэлементная электропорация, либо универсальный генератор квадратных импульсов, подключенный к осциллографу. Подключите выходы электропорации к держателю для пипетки и электроду для ванны. Убедитесь, что держатель пипетки и электрод для ванны содержат серебряные провода, покрытые тонким слоем хлорида серебра.

Затем установите держатель пипетки на микроманипулятор для точного позиционирования. После этого изготовьте микропипетки для электропорации с босиликатными стеклянными капиллярами с внутренней нитью. Установите параметры поляра микропипетки для получения более длинного хвостовика и микропипетки с меньшим отверстием наконечника с высоким сопротивлением пипетки для электропорации одиночных элементов.

Затем измерьте сопротивление пипетки непосредственно с помощью специальной электропораторной ячейки. При этой процедуре растворяют фторо-четырехсвязанный декстран в лягушачьем рингере в концентрации трех миллимоляров. Разделите этот исходный раствор на небольшие аликвоты и храните один впрок в морозильной камере.

Затем заполните микропипетку от одного до пяти микролитров раствора декстрана. Осторожно проведите микропипеткой, чтобы удалить остатки пузырьков воздуха с наконечника пипетки. Затем установите микропипетку в держатель пипетки.

Убедитесь, что серебряная проволока внутри пипетки соприкасается с раствором красителя. Теперь поместите небольшой кусочек салфетки в чашку Петри и залейте ее небольшим количеством воды, содержащей 0,02% трики. Далее обезболите предварительно метаморфического головастика в воде, содержащей 0,02% трики.

Подтвердите правильную анестезию, прикоснувшись к ней и убедившись, что она не реагирует. Затем аккуратно переложите головастика к покрытой тканью чашке Петри. Убедитесь, что электрод соприкасается с влажной тканью, и расположите наконечник микропипетки близко к обонятельному органу головастика с помощью микроманипулятора.

После этого проникают в кожу, покрывающую обонятельный орган. С помощью наконечника пипетки осторожно продвигайте наконечник в центрально расположенный слой сенсорных нейронов главного обонятельного эпителия или носового эпителия MRO. Теперь запустите импульсы положительного квадратного напряжения, чтобы передать краситель в сенсорные нейроны с помощью одного полюса напряжения или последовательности из нескольких импульсов.

Затем визуализируйте успешную экструзию красителя и электропорацию с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Краситель быстро распространяется по телу клетки и дендритам после успешной электропорации. После повторения процедур для второго органа обоняния головастика переложите головастика в стакан, наполненный пресной водой, для восстановления и позвольте электропорированному красителю распространиться на сенсорные нейроны и обонятельную луковицу.

Не менее чем через 24 часа после электропорации обезболить головастика в воде, содержащей 0,02% трики. Далее аккуратно перенесите головастика в камеру для визуализации. Вырежьте небольшой прямоугольник из полоски парама.

Затем накройте головастика парамом, оставив передний хвостовой головной мозг через вырезное окно. Закрепите параметр иголками на блюде, не травмируя головастика, и убедитесь, что головастик погружен в достаточное количество воды, содержащей 0,02% трики. Затем установите камеру визуализации на столик вертикального многофотонного микроскопа или конфокального микроскопа.

Получите трехмерную стопку изображений обонятельной луковицы и убедитесь, что процедура визуализации не превышает 10–15 минут. После этого верните головастика в обычную воду в отдельную емкость и не допускайте его попадания света. На этом изображении четыре палубные нити, соединенные с различными флюорочетверами, были электропорированы в четырех удаленных друг от друга местах обонятельного органа: боковые обозначены зеленым цветом, промежуточные обозначены желтым медиальным цветом и носовой сошник обозначены оранжевым.

Это позволяет визуализировать вспомогательную обонятельную луковицу и три основных проекционных поля основной обонятельной луковицы. На этом изображении показаны трехмерные реконструкции различных моделей роста аксонов одиночных обонятельных сенсорных нейронов, наложенных на структуру обонятельной луковицы, и здесь приведен пример одного аксона обонятельного нейрона, проецирующегося в обонятельную луковицу и образующего хохлатую арборизацию в сферическом клубочнике. Как видно здесь, в Opus Levu, эти аксоны регулярно раздваиваются, прежде чем соединиться с одним, двумя или несколькими gmer.

Это репрезентативный пример отдельного обонятельного сенсорного нейрона, многократно исследованного с помощью покадровой визуализации in vivo, показывающего непрерывные изменения в морфологии аксонов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как маркировать обонятельные сенсорные нейроны с помощью электропорации и как контролировать их развитие с помощью визуализации in vivo TimeLapse.