Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить качественную и количественную оценку паттернов арборизации аксонов моторных нейронов с помощью светового листового микроскопа и программного обеспечения для анализа изображений эмбрионов мышей. Этот метод может помочь понять развитие двигательных нейронов в координации со сложными движениями. Основное преимущество этой методики заключается в том, что вы можете наблюдать и визуализировать паттерны арборизации аксонов моторных нейронов под разными углами и количественно анализировать каждый отдельный нерв.

Демонстрировать процедуру будут Я-Пин Йен и И Шан Ляу, два аспиранта из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, зафиксируйте эмбрионы по отдельности в 24-луночной пластине с одним миллилитром свежеприготовленного 4% параформальдегида в PBS на лунку при температуре четыре градуса Цельсия на шейкер на ночь. На следующий день промойте неподвижные эмбрионы не менее трех раз, каждый в течение 5-10 минут, одним миллилитром 1X PBS и инкубируйте их в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Затем пермеабилизируйте каждый эмбрион в одном миллилитре 0,5% PBST в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на шейкере. Залейте каждый образец одним миллилитром 10% FBS, приготовленным в 1X PBS на ночь при температуре 4 градуса Цельсия на шейкере. Впоследствии инкубируют каждый эмбрион с одним миллилитром первичного антитела против GFP при температуре 4 градуса Цельсия в течение 72 часов при постоянном встряхивании.

После первичной инкубации антител промойте каждый эмбрион одним миллилитром 0,5% PBST в течение одного-двух дней при температуре четыре градуса Цельсия на шейкере. После этого внесите один миллилитр вторичного антитела и инкубируйте в течение ночи в темноте при температуре четыре градуса Цельсия при постоянном встряхивании. На следующий день промойте каждый эмбрион одним миллилитром 0,5% PBST не менее трех раз при четырех градусах Цельсия на шейкере в течение двух-трех дней.

Затем инкубируйте каждый эмбрион в коммерческом очищающем реагенте с показателем преломления 1,49nd в защищенной от света пробирке объемом 1,5 миллилитра при комнатной температуре на ночь. Настройка оптики подсветки 5X/0.1 и оптики обнаружения 5X/0.16. Соберите держатель образца и капилляр для образца.

Подготовьте камеру для образцов, заполнив ее очищающим раствором. Чтобы установить эмбрион, подготовьте наконечник для пипетки P200, отрезав верхнюю часть так, чтобы она соответствовала диаметру капилляра, и удалите заостренную часть для прикрепления образца. Затем расплавьте затупленный конец наконечника пипетки с помощью небольшого пламени.

Потушите пламя и быстро приложите зародыш вертикально к расплавленному концу. Подогните верхнюю часть наконечника пипетки к капилляру образца и поместите подготовленную камеру для образца в микроскоп. С помощью программного обеспечения для обработки изображений выберите «Найти капилляр» на вкладке «Найти» и настройте оси X, Y и Z.

Затем выберите «Найти образец» и увеличьте масштаб до 0,6X, чтобы сфокусироваться на эмбрионе. Дайте буферу камеры уравновеситься с эмбрионом в течение некоторого времени, чтобы очистить его от мусора или пузырьков. Для получения изображений на вкладке «Съемка» задайте параметры пути света, такие как цели обнаружения, фильтр блокировки лазера, светоделитель, камеры и лазеры.

Установите флажок Pivot Scan для уменьшения теней. Затем задайте параметры сбора данных: Бит от бита до 16 бит, Масштабирование до диапазона от 0,36 до 0,7X, Освещение одного объекта или Освещение двойного объекта. Нажмите кнопку Непрерывно и задайте интенсивность лазера, время экспозиции, мощность лазера и положение светового листа.

Затем нажмите Стоп, чтобы завершить получение изображения. Важно убедиться, что прозрачный образец расположен на кратчайшем пути света, чтобы можно было получить детальные изображения тонких арборизированных структур на отдельных двигательных нервах. Для многомерного сканирования определите Z-стек, переместив положение z для первого и последнего изображения.

Нажмите кнопку Оптимальный, чтобы задать номер среза. Затем нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы получить выбранный Z-стек. Когда это будет сделано, сохраните изображение в формате czi.

Чтобы количественно оценить арборизацию аксонов, откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений. Настройте цвет, яркость и контрастность изображения с помощью окна «Настройка дисплея» для обнаружения нитей на основе контраста локальной интенсивности. Затем нажмите на иконку «Добавить новые нити» и выберите алгоритм автопути в выпадающем меню.

Выберите интересующую область, затем определите начальную и исходную точки, назначив наибольший и самый тонкий диаметры, которые можно измерить в режиме Срез. Назначьте начальную точку на краю области интереса. Чтобы вручную добавить или удалить начальные точки, сначала измените режим указателя, выберите переход, а затем нажмите Shift и щелкните правой кнопкой мыши по интересующим точкам.

Затем выберите ручные пороговые значения для начальных точек, чтобы убедиться, что все видимые арборизации помечены. Затем вручную добавьте или удалите начальные точки. Установите флажок «Удалить разъединенные сегменты» и удалите исходные точки вокруг начальных точек.

Впоследствии отрегулируйте порог для вычитания фона и завершите процесс. Необходимо удалить фоновые артефакты и подтвердить, что траектория детектора отражает истинную арборизацию аксонов для точной количественной оценки. В конце выберите нужный стиль и цвет.

На вкладке Статистика выберите Detailed (Подробно) и используйте номер нити, дендритные концевые точки для количественной оценки окончаний двигательных нервов в качестве индикатора арборизации моторных аксонов. Затем экспортируйте изображение восстановленного аксона в виде tiff-файла. LSFM обеспечивает детальную 3D-визуализацию арборизации моторных аксонов у эмбрионов мышей.

Моторные нейроны подвергаются описанному выше протоколу и помечаются трансгенно-экспрессируемым GFP. Чтобы получить более подробное изображение арборизации аксонов и выполнить количественную оценку, увеличение можно отрегулировать таким образом, чтобы можно было выявить каждую тонко арборизированную структуру. Наконец, паттерн арборизации аксонов отдельных нервов передних конечностей может быть реконструирован с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Алгоритм автотраектории в программном обеспечении отслеживает филамент и количественно определяет общее количество клемм аксонов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить образцы и получать изображения аксонов моторных нейронов эмбрионов мыши с помощью светолистового флуоресцентного микроскопа. Кроме того, вы узнаете, как количественно оценить характер арборизации каждого отдельного двигательного нерва по МРС.