Четырёхкратное иммуноокрашивание обонятельной луковицы для визуализации обонятельных сенсорных аксонов Молекулярные коды идентичности

Общей целью данного метода иммуногистохимического окрашивания является визуализация комбинированной экспрессии молекул сортировки аксонов на концах аксонов обонятельных сенсорных нейронов. Этот метод может помочь охарактеризовать ключевые процессы в области развития обоняния, такие как направление аксонов, формирование синапсов и регенерация обонятельных сенсорных нейронов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет ученым сравнивать и анализировать паттерны экспрессии молекул сортировки аксонов в обонятельной луковице без поддержания вариаций между срезами.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этап встраивания трудно освоить, потому что положение и угол наклона образца обонятельных тканей в форме трудно описать словами. Начните с голов мышей в возрасте от одной до двух недель, которые были зафиксированы с помощью внутрисердечной перфузии 4% параформальдегида. Вставьте лезвие ножниц в пространство между верхними и нижними зубами, и разрежьте горизонтально, чтобы удалить нижнюю челюстную кость.

Затем обрежьте лишнюю ткань щипцами и ножницами, чтобы оставить обонятельную ткань, включая обонятельную луковицу и обонятельный эпителий. Погрузите обонятельную ткань в PBS, чтобы удалить воздух из носовой полости, затем сделайте вертикальный разрез, чтобы удалить заднюю часть мозга, и поместите обонятельную ткань на дно формы для встраивания разрезанным концом вниз. Заполните форму составом оптимальной температуры резки, а затем погрузите в жидкий азот.

После того, как ткань и ОКТ будут полностью заморожены, уравновесьте ткань в криостате при температуре 20 градусов Цельсия в течение одного часа. Теперь сделайте последовательные парасаггитальные срезы обонятельной луковицы с помощью криостата, и соберите их, приклеив стекла с покрытием MAS стекла. После прилипания сразу же просушите слайды феном.

Начните иммуноокрашивание с промывания высушенных стекол PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Заблокируйте неспецифические сайты связывания путем инкубации предметных стекол в течение одного часа с 5%-ным блокирующим раствором при комнатной температуре. Затем добавьте на каждое предметное стекло по 400 микролитров коктейля из первичных антител, разведенных в 1%-ном блокирующем растворе.

Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день выбросьте первичный раствор антител и промойте предметные стекла с ПБСТ три раза по пять минут каждый при комнатной температуре. Затем добавьте в каждое горло по 400 микролитров коктейля из вторичных антител и PBS.

Беречь от света и выдерживать в течение часа при комнатной температуре. После инкубации сбросить раствор и снова промыть предметные стекла трижды по пять минут каждый с ПБС комнатной температуры. Наконец, закрепите защитные стекла на предметных стеклах, нанеся две капли монтажного материала на каждое стекло, поместив защитное стекло и удалив пузырьки воздуха.

Получение флуоресцентных изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием соответствующего фильтра для каждого флуорофора. Отрегулируйте время экспозиции для получения флуоресцентных сигналов изображения без насыщения. Определяют структуру клубочков по иммунофлуоресцентным сигналам GLUT2.

Используйте изображение J для измерения интенсивности окрашивания молекул сортировки аксонов в клубочках. На этом изображении показан парасаггитальный срез обонятельной луковицы двухнедельной мыши, иммуноокрашенный антителами против VGLUT2, Kirrel2 показан красным цветом, семафорин 7A показан зеленым цветом, а OLPC - синим. Объединенное изображение демонстрирует, что молекулы сортировки аксонов, участвующие в клубочковой сегрегации, выражены в позиционно-независимом мозаичном узоре.

Каждый клубочек определяется флуоресцентными сигналами пресинаптического маркера VGLUT2. Клубочковые структуры окружены пунктирными линиями. Интенсивность сигнала молекул, сортирующих аксоны, измерялась в каждом клубочке.

Как видно на рисунке, молекулы сортировки аксонов по-разному экспрессируются в каждом клубочке. Например, клубок 3 имеет высокие уровни OLPC, промежуточные уровни семафорина 7A и более низкие уровни Kirrel2, и эта разница может быть количественно определена путем измерения интенсивности окрашивания. В то время как клубок 4 имеет высокий уровень OLPC и более низкий уровень Kirrel2 и семафорина 7A.

Опять же, эту разницу можно количественно измерить, измерив интенсивность окрашивания. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что следует отказаться от постфиксации с помощью ПФА и лечения раствором сахарозы, которые обычно рекомендуются. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разместить больше клубочков на участке одной обонятельной луковицы, и как выполнить высококачественное иммуноокрашивание несколькими антителами, которое можно применять к другим областям мозга.

Не забывайте надеяться, этот метод поможет вам добиться успеха в ваших будущих экспериментах.