Четырёхкратное иммуноокрашивание обонятельной луковицы для визуализации обонятельных сенсорных аксонов Молекулярные коды идентичности

Общая цель данного метода иммуногистохимического окрашивания заключается в визуализации комбинированной экспрессии молекул сортировки аксонов на терминалях аксонов обонятельных сенсорных нейронов. Этот метод может помочь в характеристике ключевых процессов в области развития обоняния, таких как наведение аксонов, формирование синапсов и регенерация обонятельных сенсорных нейронов. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет ученым сравнивать и анализировать паттерны экспрессии молекул сортировки аксонов в обонятельной луковице без возникновения вариаций между срезами.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этап заливки трудно освоить, поскольку положение и угол образца тканей обонятельного эпителия в форме сложно описать словами. Начните с голов мышей в возрасте от одной до двух недель, которые были зафиксированы путем интракардиальной перфузии 4% параформальдегидом. Вставьте лезвие ножниц в пространство между верхними и нижними зубами и сделайте горизонтальный разрез, чтобы удалить нижнюю челюстную кость.

Затем с помощью пинцета и ножниц удалите излишки тканей, чтобы оставить обонятельную ткань, включая обонятельную луковицу и обонятельный эпителий. Погрузите обонятельную ткань в PBS для удаления воздуха из полости носа, затем сделайте вертикальный разрез, чтобы удалить заднюю часть мозга, и поместите обонятельную ткань на дно формы для заморозки срезом вниз. Заполните форму компаундом для заморозки (OCT) и погрузите в жидкий азот.

После полного замораживания ткани и OCT-компаунда выдержите ткань в криостате при 20 °C в течение одного часа. Затем с помощью криостата сделайте серийные парасагиттальные срезы обонятельной луковицы и соберите их, прикрепив к предметным стеклам, покрытым MAS. После прикрепления немедленно высушите стекла с помощью фена.

Начните иммуноокрашивание с промывки высушенных предметных стекол в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Блокируйте сайты неспецифического связывания, инкубируя стекла в течение одного часа с 5% блокирующим раствором при комнатной температуре. Затем добавьте на каждое стекло 400 microliters коктейля из первичных антител, разведенных в 1% блокирующем растворе.

Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день слейте раствор первичных антител и промойте стекла PBST трижды по пять минут при комнатной температуре. Затем добавьте на каждое стекло по 400 microliters коктейля из вторичных антител и PBS.

Защитите от света и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации слейте раствор и снова промойте стекла трижды по пять минут каждый с использованием PBS при комнатной температуре. В завершение закройте стекла покровными стеклами, нанеся по две капли среды для заключения на каждое стекло, поместив покровное стекло и удалив пузырьки воздуха.

Получите флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа, используя соответствующий фильтр для каждого флуорофора. Отрегулируйте время экспозиции так, чтобы флуоресцентные сигналы на изображении не были насыщены. Определите структуру клубочка по иммунофлуоресцентным сигналам GLUT2.

Используйте Image J для измерения интенсивности окрашивания молекул сортировки аксонов внутри гломерул. На данном изображении представлен парасагиттальный срез обонятельной луковицы двухнедельной мыши, иммуноокрашенный антителами против VGLUT2, Kirrel2 (показан красным), Semaphorin 7A (показан зеленым) и OLPC (показан синим). Комбинированное изображение демонстрирует, что молекулы сортировки аксонов, участвующие в гломерулярной сегрегации, экспрессируются в виде мозаичного паттерна, не зависящего от положения.

Каждый клубочек определен по флуоресцентным сигналам пресинаптического маркера VGLUT2. Гломерулярные структуры обведены пунктирными линиями. В каждом клубочке измеряли интенсивность сигналов молекул, отвечающих за сортировку аксонов.

Как видно здесь, молекулы сортировки аксонов экспрессируются дифференциально в каждом гломеруле. Например, в гломеруле 3 наблюдаются высокие уровни OLPC, промежуточные уровни Semaphorin 7A и более низкие уровни Kirrel2; эта разница может быть количественно определена путем измерения интенсивности окрашивания. В то время как в гломеруле 4 наблюдаются высокие уровни OLPC и более низкие уровни Kirrel2 и Semaphorin 7A.

Опять же, эту разницу можно количественно оценить, измерив интенсивность окрашивания. При выполнении этой процедуры важно помнить, что следует исключить этап постфиксации с PFA и обработку раствором сахарозы, которые обычно рекомендуются. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как расположить большее количество клубочков на одном срезе обонятельной луковицы, а также о том, как проводить высококачественное иммуноокрашивание с использованием нескольких антител, что может быть применено и к другим областям мозга.

Не забывайте о надежде, этот метод поможет вам добиться успеха в ваших будущих экспериментах.