Фенотипирование мыши легочная функция В Vivo С жизненной емкости легких диффундирующих
6 января 2015 г.
Мы описываем средство для быстрого и простого измерения диффузионной способности легких у мышей и показываем, что оно достаточно чувствительно к изменениям фенотипа при множественных распространенных патологиях легких. Таким образом, эта метрика имеет прямое трансляционное значение для мышиных моделей, поскольку диффузионная способность также легко измеряется у людей.
Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы узнать, как измерить диффузионную способность легких мыши с помощью калиброванного газового хроматографа. Это достигается путем надувания легких мыши, находящейся под наркозом, газом, содержащим неон и угарный газ, удержания газа в легких в течение девяти секунд и сбора газа. Газ, выводимый из легких, затем разбавляется до двух миллилитров и вводится в газовый хроматограф.
Дифференциальное поглощение неона и окиси углерода в легких используется для расчета диффузионной способности. Это измерение может быть использовано для оценки потери функции легких в широком спектре моделей заболеваний легких. Основное преимущество этой методики перед всеми другими существующими методами измерения легочной функции у мышей заключается в том, что это очень простое воспроизводимое измерение, которое можно напрямую сравнить с аналогичными измерениями у человека.
С помощью этого метода можно проследить за изменениями в структуре легких, которые происходят при различных патологиях легких. Этот протокол начинается с настройки модуля газового хроматографа, входящего в комплект поставки аппарата, для измерения пиков азота, кислорода, неона и окиси углерода. Для этого приложения нужны только данные о неоне и угарном газе.
В приборе используется колонна с молекулярным ситом с гелием в качестве газа-носителя. Этот конкретный газовый хроматограф имеет колонку объемом 0,8 миллилитра, и образец объемом два миллилитра используется для обеспечения адекватной очистки этой колонки перед запуском. Серия измерений всегда калибрует машину с использованием двух миллилитров газа непосредственно из мешка для отбора проб газа.
Первым появляется неон, затем кислород и азот, которые мы не измеряем для этой процедуры. Наконец, пик окиси углерода — это время работы газового хроматографа. Чтобы измерить все эти пики, требуется чуть меньше минуты.
Для начала обезболите мышей кетамином и ксилазином. Подтвердите анестезию отсутствием рефлекторных движений в ответ на пощипывание пальца ноги. Далее для защиты глаз применяют ветеринарную мазь, затем трахеостомируют мышей с помощью студенской канюли.
Используйте канюлю 18 калибра для взрослых или канюлю 20 калибра для очень молодых мышей. Далее запустите метроном со слышимыми щелчками каждую секунду. Для мышей старше шести недель используйте трехмиллилитровый шприц для забора 0,8 миллилитра газа из мешка с газовой смесью.
Если мышке меньше четырех недель, используйте 0,4 миллилитра газа, затем подключите шприц к трахейной канюле и быстро надуйте легкие. Начните мысленно считать от одного до 10 синхронно с щелчками метронома. Когда счет достигнет 10, быстро извлеките 0,8 миллилитра объема.
Разбавьте этот выдыхаемый газ до двух миллилитров, добавив комнату, воздух и вес не менее чем на 15 секунд. Очень важно как можно быстрее надуть и сдуть легкие. Быстрое накачивание очень легко, но требуется немного практики, чтобы точно и быстро извлечь 0,8 мл, а затем ввести весь образец в газовый хроматограф.
При проведении анализа важно избегать загрязнения образца при передаче его к животному и к газовому хроматографу и обратно. Это можно сделать аккуратно, закрыв знак пальцем, пока ГК измеряет образец. Накачайте легкое мыши еще 0,8 миллилитрами газовой смеси из пакета, а затем обработайте этот образец идентично первому.
Используя средние значения двух измерений, рассчитайте DFCO. Нижний индекс C относится к калибровочным газам, а девятый индекс относится к образцам, собранным у животного. После девятисекундной задержки дыхания.
Номинальное контрольное значение DFCO, взятое у черных шести мышей C 57, составляет около 0,77. В исследовании с использованием модели гриппа PR 8 прогрессирующая потеря функции наблюдалась на шестой и восьмой день в модели эмфиземы через 21 день после установки эластаз. DFCO был умеренно снижен, но наблюдались гораздо большие изменения в модели фиброза, вызванного установкой Blio Mycin.
Фиброзный путь, вызванный блеомицином, привел к наибольшему изменению DFCO, наблюдаемому в любой из патологических моделей. Это важно, так как диффузионная способность также является надежным маркером фиброза у человека. Ген CFTR играет решающую роль в развитии муковисцидоза, и в исследовании мышей, лишенных этого гена, наблюдалось значительное снижение DFCO.
DFCO был дополнительно снижен при грибковой инфекции у этих нокаутных мышей. Часто используемой моделью повреждения легких является ЛПС. У мышей, подвергшихся воздействию ЛПС, наблюдалась прогрессирующая потеря функции легких в зависимости от времени с первого по четвертый день.
Меньший размер легкого требует меньшего объема надувания – 0,4 миллилитра. DFCO, измеренный с этим меньшим объемом, способен показать ожидаемое увеличение по мере созревания легкого после освоения. Этот метод может быть выполнен всего за несколько минут на каждой мыши, прежде чем проводить какие-либо другие измерения или оценки функции легких.
При выполнении этой процедуры важно убедиться, что этап надувания и сдувания выполняется быстро, а также быть осторожным при переносе образца, чтобы предотвратить загрязнение.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье описан метод измерения диффузионной способности легких у мышей с использованием калиброванного газового хроматографа. Эта техника чувствительна к изменениям фенотипа при различных заболеваниях легких, что делает ее актуальной для трансляционных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Физиология дыхания
- Трансляционные исследования
Фон
- Диффузионная способность легких является критичной мерой функции легких.
- Существующие методы измерения функции легких у мышей могут быть сложными.
- Сравнительные исследования между мышами и людьми необходимы для трансляционной актуальности.
- Для эффективных исследований необходимы простые и воспроизводимые методы.
Цель исследования
- Разработать прямолинейный метод измерения диффузионной способности легких у мышей.
- Оценить потерю функции легких в различных моделях заболеваний легких.
- Облегчить сравнение измерений функции легких между мышами и людьми.
Используемые методы
- Инфляция легких мышей под наркозом газовой смесью, содержащей неон и оксид углерода.
- Удержание газа в легких в течение девяти секунд перед сбором.
- Разбавление собранного газа до двух милилитров для анализа.
- Использование газового хроматографа для измерения дифференциального поглощения газов.
Основные результаты
- Метод обеспечивает надежное измерение диффузионной способности легких.
- Он чувствителен к изменениям функции легких, связанным с различными патологиями.
- Техника проста и воспроизводима, что увеличивает ее применимость в исследованиях.
- Результаты могут быть непосредственно сопоставлены с аналогичными измерениями у людей.
Выводы
- Этот метод представляет собой ценный инструмент для оценки функции легких в моделях мышей.
- Он поддерживает трансляционные исследования, сопоставляя измерения между мышами и людьми.
- В будущих исследованиях можно использовать эту технику для более эффективного исследования патологий легких.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
