Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении симуляции и убиквитинации кинетических белков ядра почковающихся дрожжей, NDC 10 и NDC 80. Это достигается путем сбора дрожжевых клеток, которые экспрессируют флаг шипения, меченный SMT 3, и MT, меченный NDC 10 или NDC 80, и получение белковых экстрактов из этих клеток. Вторым шагом является очистка трех конъюгатов с маркировкой SMT для обнаружения суммирования или для иммуноосаждения белков кинетического ядра mik tagg для обнаружения убиквитинации.

Впоследствии суммирование или убиквитинация обнаруживается с помощью вестерн-блоттинга. В конечном счете, наличие лестничного паттерна для NDC 10 и NDC 80 подтверждает, что эти белки моделируются и убиквитинируются. Описанный метод очистки белков позволяет обнаруживать как моделирование, так и убиквитинацию белков коннико ND C 10 и NDC 80 в почковающемся дрожжевом крестце.

Моя cci. Основное преимущество этой методики заключается в том, что созданный нами штамм имеет две эпитопные атаки, одну на тестовый белок, а другую позволяющую детектировать симуляцию. Использование этих меток снижает фон из-за перекрестной реактивности, которая часто наблюдается при использовании поликлональной сыворотки.

Демонстрация этой процедуры будет проведена Канеро Уни, научным сотрудником в моей лаборатории. Представляющие интерес белки будут экстрагированы из гранул дрожжевых клеток, приготовленных заранее и хранящихся при температуре минус 20 градусов Цельсия. Восстановите, суспензируйте клетки в 0,5 миллилитрах ледяного буфера.

Используйте гиновый буфер, если экстракт предназначен для понижающего анализа с использованием никелевого нитрила, триуксусной кислоты или гранул никелевого NTA. Используйте буфер А, если экстракт предназначен для иммунопреципитации. Всегда держите трубки на льду.

Перелейте в ячейку суспензию до двух миллилитров. Закрутите крышку по две на каждую трубку. Добавьте объем стеклянных шариков, равный объему клеточного суспензионного шарика.

Взбейте ячейки в мини-венчике в течение двух минут при комнатной температуре, а затем поместите трубки на лед на две-три минуты. Повторите взбивание бусин и глазурь три раза. Вихрь на высокой скорости при температуре четыре градуса Цельсия от 30 до 60 минут.

Проверьте клетки с помощью визуализации под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки лизируются. Лизированные клетки будут выглядеть как темные призраки и не будут иметь границ или определенной формы. Оптимально, по крайней мере, 80% клеток должны быть лгаемыми.

Затем с помощью булавки проколите отверстие в дне трубки. Плотно наденьте завинчивающуюся крышку и поместите трубку в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте при 1000 умноженных на G в течение одной минуты.

Чтобы собрать лизат, перенесите лизат в микроцентрифужную центрифугу при температуре 15 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия для сбора извлеченных белков. После измерения концентрации экстрагированных белков с помощью набора для анализа белка нормализуйте все экстракты, чтобы каждый из них содержал одинаковое количество белка. Доведите общий объем до одного миллилитра с помощью соответствующего буфера.

Примерно пять миллиграммов общего белка получают из 50 OD 600 клеток. Сохраните 50 микролитров извлеченного белка в виде экстракта всей клетки. Оставшиеся 950 микролитров белкового экстракта будут использованы позже для очистки белка или иммунопреципитации белков, меченных MT.

Добавьте 50 микролитров двух x laly sample buffer к 50 микролитрам экстракта цельных клеток. Инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в термоблоке в течение трех-пяти минут, прежде чем анализировать их с помощью вестерн-блоттинга. Начните эту процедуру с подготовки никелевых бусин NTA superflow, необходимых для очистки.

Получите необходимое количество гранул с помощью центрифугирования на низкой скорости в течение одной минуты. Снимите надосадочную жидкость и промойте шарики PBS. Добавьте один миллилитр PBS и переверните трубку сверху вниз, пока бусины не будут снова суспензированы.

Соберите шарики методом центрифугирования на низкой скорости и удалите надосадочную жидкость. Стирайте бусины таким образом в общей сложности пять раз. Суспензируйте бусины в одном миллилитре гинового буфера и распределите их по количеству пробирок, соответствующему образцам, подлежащим обработке.

Соберите шарики методом центрифугирования на низкой скорости и удалите надосадочную жидкость для каждого образца. Добавьте 950 микролитров экстракта целых клеток. Готовится заранее до 100 микролитров бусин.

Инкубируйте на качающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия не менее четырех часов или в течение ночи. Центрифугируйте при температуре от 800 до 1500 раз G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Сэкономьте 50 микролитров надосадочной жидкости.

Добавьте 50 микролитров двух x laly буфера для образцов в эту надосадочную жидкость и инкубируйте при температуре 100 градусов Цельсия в тепловом блоке в течение трех-пяти минут. 10 микролитров каждого образца позже будут проанализированы с помощью вестерн-блоттинга. Промойте никелевые бусины NTA Superflow один раз с одним миллилитром гинового буфера в течение пяти-10 минут на качающейся платформе при комнатной температуре.

Далее промойте бусины пять раз с одним миллилитром буфера для разбивания, после окончательной промывки с буфером для разрыва суспендируйте бусины в 90 микролитрах двух х лали образца буфера. Добавьте 10 микролитров одного молярного йоля, чтобы помочь диссоциировать меченый белок от никелевого NT. Бусины инкубируются при температуре 100 градусов Цельсия в нагревательном блоке в течение трех-пяти минут. Затем Vortex центрифугирует при 13 000 перегрузках в течение 30 секунд.

Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Чтобы начать эту процедуру, необходимо получить необходимое количество антител анти-cmic аэроаффинного геля путем центрифугирования на низкой скорости. Удалите надосадочную жидкость, промойте смолу буфером А Добавьте один миллилитр буфера А и переверните сверху вниз до тех пор, пока смола не станет ресуспензией.

Соберите смолу методом центрифугирования на низкой скорости и удалите надосадочную жидкость. Стирайте в общей сложности пять раз. Суспендируйте смолу в одном миллилитре буфера А и аликвоте в количество пробирок, соответствующее обрабатываемым образцам.

Соберите смолу методом центрифугирования на низкой скорости и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 950 микролитров экстракта цельных клеток к 25 микролитрам смолы Инкубируйте на качающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи на следующий день. Центрифугируйте при температуре от 800 до 1500 раз G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Сэкономьте 50 микролитров надосадочной жидкости. Добавьте 50 микролитров двух х миллионов буферов для образцов в эту надосадочную жидкость и инкубируйте при температуре 100 градусов Цельсия в тепловом блоке в течение трех-пяти минут. Промойте смолу с буфером и добавьте один миллилитр буфера, переверните верх над низом до тех пор, пока смола снова не станет суспензией.

Соберите смолу методом центрифугирования на низкой скорости и удалите надосадочную жидкость после удаления надосадочной жидкости из окончательной промывки. Повторно суспендируйте смолу в 100 микролитрах буфера для образца сума, инкубируйте при 100 градусах Цельсия в тепловом блоке в течение трех-пяти минут. Затем Vortex центрифугирует при 13 000 перегрузках в течение 30 секунд.

Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Наконец, загрузите все образцы, собранные из этого протокола. На странице SDS, геле для вестерн-блоттинга, штаммы дрожжей, экспрессирующие полигистамин с маркировкой SMT 3 или HF SMT 3 и MT с метками NDC 80 и NDC 10, были использованы для обнаружения кинетических белков.

Три субстрата HF SMT были аффинно очищены с использованием никелевых шариков и обнаружены антителом Anti-Flag. Суммированный NDC 80 был обнаружен в трех субстратах ВЧ SMT при зондировании анти-мик-антителом. Отсутствие модифицированных белков в контрольных штаммах без HF SMT 3 указывает на специфичность взаимодействия между HF SMT 3 и его белками-мишенями.

Кроме того, суммирование NDC 80 и NDC 10 уменьшается в клетках, обработанных десоли NOCO, для обнаружения убиквитинации NDC 80 и NDC 10. Мик, меченный ND C 80 или ND C 10, был иммунопреципитирован, и вестерн-блоттинг был проведен с антителами к MIC и антиубиквитину; анализ цельного клеточного экстракта и надосадочной жидкости подтвердил экспрессию NDC 80 M и NDC 10 M. Иммуноципитированные образцы, исследованные с помощью анти MIC, показали множественные полосы с высокой молекулярной массой, что позволяет предположить, что NDC 80 и NDC 10 содержат посттрансляционные модификации. Лестничная модель образцов, преципитированных с иммунитетом, исследованных с помощью антиубиквитина, показала, что ND C 80 и ND C 10 убиквитинированы.

Лестничные паттерны NDC 80 и NDC 10 были усилены обработкой ингибитором протеасом MG 1 32. Еще одно подтверждение того, что они представляют собой полиубиквитинацию После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о технике очистки белка, которая позволяет обнаруживать спаривание и вакцинацию НН летучих мышей.