В пробирке SUMOylation Assay для изучения сумо E3 лигаза активность

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы проверить интересующий нас белок, который может быть SUMOylated или является SUMO E3 лигазой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области SUMOylation, такие как идентификация лигазы SUMO E3. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть использована для исследования специфичности лигазы SUMO E3 по отношению к различным изоформам SUMO.

Демонстрировать процедуру будет Ван-Шань Янг, аспирант из моей лаборатории. Чтобы очистить метку K-bZIP, сначала инкубируйте 10 миллилитров клеточного лизата с 50 микролитрами магнитных шариков, помеченных антителами, в 14-миллилитровой полипропиленовой пробирке. Затем вращайте трубку со скоростью 50 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение трех часов в суспензионном миксере.

После того, как белок захвачен, центрифугируйте образец при 800 умноженных на г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать шарики. Выбросьте все надсадочную жидкость, кроме одного миллилитра, чтобы повторно суспендировать шарики. И переложите растворенные шарики в 1,5-миллилитровую трубку.

Чтобы промыть захваченные белки, поместите пробирку с бусинами на магнитную подставку. Подождите около трех секунд, чтобы шарики прилипли к боковым стенкам трубки, а затем удалите надосадочную жидкость. Чтобы промыть бусины, добавьте один миллилитр буфера для лизиса в 1,5-миллилитровую пробирку.

Затем переверните трубку десять раз. Далее поместите 1,5-миллилитровую трубку на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость, как только бусины прилипнут к стенкам. Чтобы снова промыть бусины, добавьте один миллилитр фосфатного буферного раствора в 1,5-миллилитровую трубку и переверните ее десять раз.

Затем перенесите трубку на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость, как только бусины прикрепятся к боковым стенкам. Чтобы элюировать помеченные K-bZIP белки из магнитных шариков, помеченных антителами, добавьте 100 микролитров в концентрации 150 микрограммов на миллилитр октапептида, разведенного в фосфатно-солевом буфере в 1,5-миллилитровой пробирке. Затем вращают трубку на суспензионном миксере со скоростью 50 оборотов в минуту в течение десяти минут при комнатной температуре.

Перенесите трубку на магнитную подставку. А затем соберите K-bZIP, содержащий надосадочную жидкость. Затем для анализа очищенной метки K-bZIP подвергните страницу SDS от одного до пяти микролитров очищенного белка, после чего подайте окрашивание в синий цвет Кумасси.

Загрузите 0,5, 1 и 2 мкг бычьего сывороточного альбумина в качестве стандартных на гель для количественного определения концентрации K-bZIP. Во время обработки изображения на изображении J.Next разведите очищенный K-bZIP в фосфатно-солевом буфере. Для достижения конечной концентрации 100 нанограмм на микролитр.

И хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Добавьте три микролитра по 100 нанограмм на микролитр очищенного меченого K-bZIP в реакцию мастер-микса in vitro SUMOylation. Затем перемешайте содержимое мастер-смеси аккуратно и выдержите при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех часов.

Далее добавьте 20 микролитров страницы 2X SDS с буфером загрузки для остановки реакции. Затем нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы денатурировать белок. Затем загрузите 20 микролитров образца в 10%-ный гель SDS.

И запустите гель при напряжении 80 вольт в течение примерно 120 минут, пока краситель не достигнет дна геля. Как только электропарез закончится, отсоедините гелевый аппарат. И переложите гель в полусухой буфер для переноса на пять минут.

Затем замочите мембрану из ПВДФ в другой емкости, наполненной метанолом, на одну минуту. Снимите мембрану из ПВДФ с метанола и замочите в полусухом буфере для переноса. Затем аккуратно взбалтывайте мембрану в течение пяти минут.

Снимите предохранительную крышку полусухого электрофоретического аппарата. Предварительно намочите фильтровальную бумагу. И приготовьте гелевый бутерброд на дне платинового анода.

Закрепив катодную пластину в защитной крышке, запустите кляксу при постоянном токе 15 вольт в течение 90 минут. Затем выключите блок питания и выньте мембрану PVDF после отсоединения полусухого аппарата. Теперь заблокируйте мембрану из ПВДФ блокирующим буфером на один час при комнатной температуре на орбитальном вибростенде со скоростью 30 оборотов в минуту.

Затем гибридизируйте мембрану PVDF с антителом против p53 и блокирующим буфером в течение 12-16 часов при четырех градусах Цельсия на смесителе суспензий со скоростью 30 оборотов в минуту. Затем извлеките мембрану из ПВДФ и переложите в емкость, наполненную трис-буферным физиологическим раствором 20. Затем замочите мембрану из ПВДФ в трис-буферном солевом твиноде на 20 минут на орбитальном вибростенде со скоростью 45 оборотов в минуту.

Затем гибридизируют мембрану PVDF с антителом против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенным в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре на смесителе суспензий со скоростью 30 оборотов в минуту. Затем промойте мембрану из ПВДФ с помощью Трис-буферного физиологического раствора 20 трижд. После промывки замочите мембрану из ПВДФ в трис-буферном физрастворе 20 на 30 минут на смесителе для суспензии со скоростью 45 оборотов в минуту.

Затем замените трис-буферизованный физиологический раствор tween 20 на фосфатно-солевой буфер. Сохранить мембрану из ПВДФ при температуре четыре градуса Цельсия до 12 часов. Затем смешайте усиленные хемилюминесцентные реагенты подложки один и два в соотношении один к одному.

Затем снимите мембрану PVDF с буферизованным фосфатами физиологическим раствором и кратковременно промокните карманами пунша, чтобы впитать лишнюю влагу. Сразу же добавьте 400 микролитров хемилюминесцентного реагента на поверхность мембраны и подождите три-пять минут. Кратковременно промокните, чтобы слить излишки хемилюминесцентного реагента, не допуская полного высыхания мембраны.

Используйте систему визуализации Luminescent, чтобы обнажить блот. Здесь был проведен иммуноблоттинг, чтобы показать концентрацию фермента Ubc9, необходимую для SUMOylatирования мишеней p53. Это показывает, что 1/2 и 1/5 концентрации фермента Ubc9 могут в достаточной степени SUMOylate p53 фермента в анализе SUMOylation in vitro с использованием пептидов SUMO 1 и SUMO 2.

Для анализа SUMOylated p53 мембрану зондировали антителом против p53. Аналогичный иммуноблоттинг был проведен, чтобы показать, что для SUMOylatирования мишени p53 в in vitro требуется половина концентрации E1 и 1/10 ферментов Ubc9 в анализе SUMOylation с использованием пептидов SUMO 1, SUMO 2 и SUMO 3. Здесь мембрана была окрашена Кумасси, чтобы показать очищенный белок K-bZIP.

Для экспрессии очищенного K-bZIP использовали систему экспрессии бакуловируса, который анализировали на странице SDS с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта для сравнения. Также был проведен дополнительный иммуноблоттинг, который показал, что при повышении концентрации K-bZIP он катализирует SUMOylation p53 в присутствии половины количества ферментов E1 и 1/10 количества ферментов Ubc9 соответственно. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что весь реагент для анализа SUMOylation in vitro должен быть заморожен и проводить серийное разведение, а не в одном гигантском разведении. Найдите эту процедуру, другие методы, такие как сверхэкспрессия SUMOlygase, которые могут быть выполнены для того, чтобы проверить SUMOlygase in vitro. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области SUMOlygase к изучению большего количества SUMOlygase и подтверждению их специфичности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить лигазу SUMO e3 с помощью симуляционного анализа in vitro.