Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении белков дрожжей с сохранением взаимодействия функций нативной структуры и посттрансляционных модификаций. Это достигается путем выращивания сначала клеток для индуцирования экспрессии белка, представляющего интерес. Затем собранные дрожжевые клетки гомогенизируются в подходящем буфере для извлечения белков.

Затем представляющие интерес белки очищают из осветленного экстракта цельных клеток с использованием аффинности смолы. Заключительным этапом процедуры является выделение очищенных белков из аффинной смолы для дальнейшего анализа или последующего применения. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают модификации и взаимодействия в очистке белков на основе вестерн-блоттинга.

Демонстрировать процедуру будет Ева Ки, выпускница Уильяма и Мэри, которая последние пару лет работала исследователем в моей лаборатории. Основным преимуществом бисероплетения по сравнению с другими существующими методами является быстрая обработка и лизис нескольких образцов в условиях, сохраняющих взаимодействие белковых функций и посттрансляционные модификации. Чтобы начать трансформацию клеток гальположительного штамма дрожжей с плазмидой, кодирующей индуцируемую галактозой шесть, его меченый белок выбора инокулировать трансформанты в 5 миллилитров соответствующей селективной среды, такой как SD урацил, содержащей 2% сахарозы, и инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение ночи с вращением, на следующий день разбавить ночную культуру в селективной среде с 2% сахарозы до конечного объема 33 миллилитра так, чтобы оптическая плотность составила 600 нанометры имеют отмерку 0,3, растут в трясущемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 150 оборотах в минуту.

Когда культура достигнет наружного диаметра 600 от 0,8 до 1,5, индуцируйте экспрессию желаемого белка путем добавления 17 миллилитров трех XYEP с 6% галактозой для получения конечной концентрации одного XYEP с 2% галактозой, помещенного в встряхивающий инкубатор при 30 градусах Цельсия еще на пять-шесть часов. После измерения наружного диаметра 600 индуцированной культуры центрифугируйте примерно от 150 до 200 OD 600 единиц клеток в течение пяти минут при 5000 об/мин при четырех градусах Цельсия, затем используйте один миллилитр ледяного одного XPBS с одним коктейлем ингибитора протеазы для повторного суспендирования неба клетки и перенесите его в двухмиллилитровую пробирку с винтовой крышкой, центрифугируйте клетки в течение одной минуты при 15 градусах. 000 об/мин и четыре градуса Цельсия. После сцеживания надосадочной жидкости заморозьте клеточную гранулу в жидком азоте до замороженной клеточной гранулы.

Добавьте 200 микролитров промытых кислотой стеклянных шариков и 500 микролитров ледяного буфера для лизиса. Постоянно держите трубки на льду. Используйте наконечник для дозатора с отрезанным концом, чтобы кратковременно проводить пипетку вверх и вниз при температуре четыре градуса Цельсия.

Поместите трубки ячеек в балансировочный замок бисерной мельницы и запустите машину в соответствии с инструкциями производителя в течение 20 секунд со скоростью 5,5 метра в секунду. Затем поместите трубочки на слякотный лед на одну минуту. Повторите в общей сложности шесть раз, чтобы очистить экстрагированные белки. Центрифуга в течение 15 минут при 15 000 об/мин при четырех градусах Цельсия.

Затем подготовить образец экстракта целой клетки или WCE для вестерн-блоттинга и WCE, соответствующего двум наружным диаметром 600 единиц клеток до 800 микролитров 20% трихлоруксусной кислоты или вихря TCA для смешивания. Чтобы очистить образец прозрачной WCE в концентрации от 50 до 100 микролитров аффинной смолы в новой микроцентрифужной пробирке, промойте и уравновесьте смолу, добавив один миллилитр промывочного буфера, и переверните сверху вниз до тех пор, пока смола не станет ресуспензией. После отжима в течение одной минуты при 5 000 об/мин и четырех градусах Цельсия аспирируйте надосадочную жидкость для связывания белка для аффинной очистки в диапазоне от 100 до 200 микролитров очищенного лизата к промытым гранулам и используйте буфер для лизиса, чтобы довести общий объем до одного миллилитра.

Инкубируйте с мутацией или при четырех градусах Цельсия в течение двух-пяти часов. Используйте жидкий азот для мгновенной заморозки аликвот оставшейся прозрачной WCE и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования, пока раствор лизата свеклы инкубируется для образца вестерн-блоттинга WCE на льду. После вращения в течение двух с половиной минут при 15 000 об/мин при четырех градусах Цельсия, сцедите надосадочную жидкость, заботясь о сохранении гранулы, добавьте 800 микролитров 2% ТСА в гранулу и перебейте трубку перед повторением двух с половиной минут вращения.

После тщательного сцеживания надосадочной жидкости добавьте 100 микролитров буфера для образца ТСА и вортекс для растворения гранулы перед инкубацией образца. В нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут требуется второй раз для полного растворения любых остатков гранул, которые бывает трудно растворить и хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к использованию. После того, как образец лизатного шарика инкубирован, после вращения со скоростью 5000 об/мин и четырех градусов Цельсия в течение одной минуты, используйте буфер для промывки смолы пять раз, чтобы вымыть белки.

Добавьте 150 микролитров элюирующего буфера в смолу при температуре четыре градуса Цельсия на пять минут. Вращайте в течение одной минуты со скоростью 5 000 об/мин и четырьмя градусами Цельсия и сохраните надосадочную жидкость в новой трубке. Наконец, подготовить образец для вестерн-блоттинга при концентрации 25 микролитров двух x докаль-сульфата лития в буфере с двумя микролитрами BME на 25 микролитров образца белка UD.

Как показано на этом рисунке, широкий спектр белков может быть воспроизводимо извлечен из дрожжевых клеток. Дискретные полосы в диапазоне молекулярных масс указывают на высокое качество белковых экстрактов. Качество экстрактов может быть подтверждено вестерн-блоттингом для специфических белков, меченных эпитопами.

Вот репрезентативный результат для галоктозы с гиперэкспрессией V 5, помеченной сумо-лигазой, которая мигрирует со скоростью около 120 килодальтон. Как правило, частично расщепленные белки будут содержаться в виде множественных фрагментов ниже ожидаемого веса, но здесь наблюдается только полноразмерный белок. Кроме того, высокомолекулярное добавление данного белка может указывать на посттрансляционные модификации.

Например, здесь вы можете увидеть лактозу над экспрессией, связанной с сумо, S one delta four 40 и полной длины SIS one. Как показано в данной работе, модификации вестерн-блоттинга могут сохраняться и на эндогенно экспрессируемом S-блоке. На этом рисунке показано, что два обогащенных ядра белка SLX five и CS one delta four 40 были успешно очищены из нашего ws.

Примечательно, что белок, меченный шестью шипениями, может быть аффинно очищен от W'S как в нативных, так и в денатурирующих условиях. В отличие от них, SLX 5G ST и CS one delta four 40 ha не имеют эпитопа с шестью шипениями, но в естественных условиях все еще взаимодействуют со смолой сродства металла весьма чувствительным образом. Мы предполагаем, что CIS One и в меньшей степени SLX 5 способны связывать металлическую аффинную смолу через свой металлический координирующий кольцевой домен.

Хотя, насколько нам известно, об этом конкретном явлении еще не сообщалось, была описана аналогичная ситуация, при которой субъединица токсина В холе связывается со смолой Nicola сродства таким образом, что это опосредовано ее естественными остатками гистамина. Это наблюдение позволяет предположить, что белки в WCER, по крайней мере частично, изначально свернуты для изучения функции белка. Важно показать, что белковые комплексы остаются нетронутыми в экстрактах цельных клеток.

Репрезентативные данные показали, что в WS cis 1 присутствовали CS one, delta four, 40 SLX five, и P GK one, цитозольный белок, который служит в качестве контроля нагрузки. Delta four 40 был очищен от этих экстрактов на основе присущей ему способности связываться со смолами сродства металлов. Кроме того, когда SLX 5 и SIS 1 были соэкспрессированы в дрожжевых клетках, уровни SLX 5 в EIT были увеличены, что повысило вероятность того, что SLX 5 может взаимодействовать с SIS one.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать и обрабатывать дрожжевые клетки, чтобы извлекать, очищать и визуализировать дрожжевые белки в нативных условиях.