Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Общая цель данной процедуры заключается в экстракции белков дрожжей с сохранением нативных структурно-функциональных взаимодействий и посттрансляционных модификаций. Для этого сначала выращивают клетки для индукции экспрессии целевого белка. Затем собранные дрожжевые клетки гомогенизируют в подходящем буфере для экстракции белков.

Затем интересующие белки очищают из осветленного экстракта целых клеток с использованием аффинной смолы. Заключительным этапом процедуры является элюирование очищенных белков из аффинной смолы для последующего анализа или дальнейшего использования. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие модификации и взаимодействия белков на основе вестерн-блот-анализа.

Процедуру продемонстрирует Ева, выпускница колледжа Уильяма и Мэри, которая последние несколько лет работала в моей лаборатории в качестве студента-исследователя. Основным преимуществом механического измельчения с помощью стеклянных шариков (bead beading) по сравнению с другими существующими методами является быстрая обработка и лизис множества образцов в условиях, сохраняющих функции белков, их взаимодействия и посттрансляционные модификации. Для начала трансформируйте клетки галактозо-положительного штамма дрожжей плазмидой, кодирующей галактозо-индуцибельный белок с 6xHis-тегом вашего выбора. Инокулируйте трансформанты в 5 мл соответствующей селективной среды, такой как SD-урацил, содержащая 2% сахарозы, и инкубируйте при 30 °C в течение ночи при перемешивании. На следующий день разбавьте ночную культуру в селективной среде с 2% сахарозы до конечного объема 33 мл, чтобы оптическая плотность при 600 нм составляла 0,3; выращивайте в шейкере при 30 °C и 150 об/мин.

Когда культура достигнет OD 600 от 0.8 до 1.5, индуцируйте экспрессию нужного белка, добавив 17 мл 3X YEP с 6% галактозы для достижения конечной концентрации 1X YEP с 2% галактозы, и поместите культуру в шейкер-инкубатор при 30 °C еще на пять-шесть часов. Измерив OD 600 индуцированной культуры, центрифугируйте количество клеток, соответствующее примерно 150–200 единицам OD 600, в течение пяти минут при 5 000 RPM и 4 °C, затем используйте 1 мл ледяного 1X PBS с 1X коктейлем ингибиторов протеаз для ресуспендирования клеточного осадка и перенесите его в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл; центрифугируйте клетки в течение одной минуты при 15 000 RPM и 4 °C. После слива супернатанта подвергните клеточный осадок мгновенной заморозке в жидком азоте.

Добавьте 200 µL промытых кислотой стеклянных шариков и 500 µL ледяного лизисного буфера. Постоянно держите пробирки на льду. Используя наконечник пипетки с обрезанным концом, несколько раз пропипетируйте смесь при температуре 4 °C.

Поместите пробирки с клетками в зажим балансировки бисерной мельницы и запустите прибор в соответствии с инструкциями производителя на 20 секунд при скорости 5.5 meters per second. Затем поместите пробирки в ледяную крошку на одну минуту. Повторите процедуру в общей сложности шесть раз. Затем центрифугируйте экстракт белков в течение 15 минут при 15, 000 RPM и температуре four degrees Celsius.

Затем для подготовки образца экстракта целых клеток или WCE для вестерн-блоттинга добавьте количество WCE, соответствующее двум единицам OD 600 клеток, к 800 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (TCA) и перемешайте на вортексе. Чтобы получить очищенный образец WCE, перенесите от 50 до 100 мкл аффинной смолы в новую микроцентрифужную пробирку; промойте и уравновесьте смолу, добавив 1 мл промывочного буфера, и переворачивайте пробирку до полного ресуспендирования смолы. После центрифугирования в течение одной минуты при 5 000 об/мин и 4 °C аспирируйте супернатант. Для связывания белка при аффинной очистке добавьте от 100 до 200 мкл очищенного лизата к промытым гранулам и доведите общий объем до 1 мл с помощью буфера для лизиса.

Инкубируйте при перемешивании или на качалке при 4 °C в течение двух-пяти часов. Используйте жидкий азот для мгновенной заморозки аликвот оставшегося прозрачного WCE и храните их при -80 °C до дальнейшего использования, пока раствор лизата для образца WCE для вестерн-блоттинга инкубируется на льду. После центрифугирования в течение двух с половиной минут при 15 000 об/мин при 4 °C слейте супернатант, стараясь сохранить осадок, добавьте к осадку 800 µL 2% TCA и перемешайте пробирку на вортексе перед повторным центрифугированием в течение двух с половиной минут.

После осторожного декантирования супернатанта добавьте 100 µL образцового буфера TCA и перемешайте на вортексе для растворения осадка перед инкубацией образца. Поместите образец в термоблок при температуре 100 °C на две-пять минут, чтобы повторно полностью растворить любые остатки осадка, который может трудно растворяться, и храните при температуре −80 °C до начала использования. После инкубации образца с лизирующими микросферами центрифугируйте его при 5 000 RPM и температуре 4 °C в течение одной минуты, затем пять раз промойте смолу промывочным буфером для элюции белков.

Добавьте 150 µL элюирующего буфера к смоле, инкубируйте при температуре 4 °C в течение пяти минут. Центрифугируйте в течение одной минуты при 5 000 RPM и 4 °C, затем перенесите супернатант в новую пробирку. Наконец, для подготовки образца для вестерн-блоттинга добавьте 25 µL 2x буфера для образцов с додецилсульфатом лития и 2 µL BME к 25 µL образца белка UD.

Как показано на этом рисунке, из клеток дрожжей можно воспроизводимо экстрагировать широкий спектр белков. Дискретные полосы в диапазоне различных молекулярных масс свидетельствуют о высоком качестве белковых экстрактов. Качество экстрактов может быть подтверждено с помощью вестерн-блоттинга на специфические белки с эпитопными метками.

Ниже представлен типичный результат для Sumo-лигазы с пятью метками при гиперэкспрессии V под контролем галактозы: полоса мигрирует на уровне примерно 120 килдальтон. Как правило, частично деградировавшие белки проявляются в виде нескольких фрагментов ниже ожидаемого веса, однако в данном случае наблюдается только полноразмерный белок. Кроме того, наличие полос с более высоким молекулярным весом для конкретного белка может указывать на посттрансляционные модификации.

Например, здесь представлены гиперэкспрессированные в присутствии лактозы sumo-связанные S1δ440 и полноразмерный S1. Как показано на данном вестерн-блоте, модификации могут сохраняться и на эндогенно экспрессируемом S1. На этом рисунке видно, что два обогащенных в ядре белка, SLX5 и S1δ440, были успешно очищены из наших образцов.

Примечательно, что белок с шестью остатками гистидина (6xHis) может быть очищен методом аффинной хроматографии из W'S как в нативных, так и в денатурирующих условиях. Напротив, SLX 5G ST и CS one delta four 40 ha не имеют эпитопа 6xHis, но в нативных условиях все равно взаимодействуют со смолой для металл-аффинной хроматографии, причем это взаимодействие чувствительно к воздействию имидазола. Мы полагаем, что CIS one и в меньшей степени SLX five способны связываться со смолой для металл-аффинной хроматографии с помощью своего металл-координирующего RING-домена.

Хотя, насколько нам известно, данный конкретный феномен еще не был описан, была описана аналогичная ситуация, при которой субъединица B холерного токсина связывается с никель-аффинной смолой за счет своих природных остатков гистидина. Это наблюдение позволяет предположить, что белки в WCER, по крайней мере частично, сохраняют нативную складку для изучения функций белка. Важно показать, что белковые комплексы остаются неповрежденными в экстрактах целых клеток.

Репрезентативные данные показали, что CS one delta four 40, SLX five и P GK1 — цитозольный белок, используемый в качестве контроля загрузки, — присутствовали в WS cis one. Delta four 40 был очищен из этих экстрактов на основании его способности связываться с металлоаффинной смолой. Кроме того, при коэкспрессии SLX five и SIS one в клетках дрожжей уровни SLX five в EITs повышались, что указывает на возможность взаимодействия SLX five с SIS one.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выращивать и обрабатывать дрожжевые клетки для экстракции, очистки и визуализации белков дрожжей в нативном состоянии.