Масс-спектрометрический подходы к изучению структуры белка и взаимодействия в лиофилизированных порошков

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге структуры белка с высоким разрешением с использованием обмена эмит-водорода, дейтерия и литического мечения боковой цепи в сочетании с масс-спектрометрией. Это достигается путем первичной лиофилизации, белка в присутствии различных вспомогательных веществ. При твердофазном обмене водорода дейтерий лиофилизированный белок подвергается воздействию паров оксида дейтерия в герметичном влагопоглотителе при контролируемой относительной влажности и температуре.

Для литического мечения белок лиофилизируют с помощью вспомогательных веществ и фотореактивного агента. Затем флакон облучают ультрафиолетовым светом для ковалентного присоединения агента к белку. Для каждого метода образцы восстанавливаются и анализируются с помощью масс-спектрометра с разрешением как на уровне интактного белка, так и на уровне пептида.

Эти два метода предоставляют дополнительную информацию. Составы, в которых структура белка в значительной степени сохраняется, демонстрируют снижение поглощения дейтерия и увеличение литического мечения, в то время как препараты с нарушенной структурой демонстрируют повышенное поглощение дейтерия и снижение литического мечения. Химическое мечение, такое как водородный дейтериевый обмен и фотосшивание в сочетании с масс-спектрометрическим анализом, недавно было адаптировано для изучения структуры белка и взаимодействий в живых носителях.

Основное преимущество этих методов по сравнению с существующими методами, такими как CD и FDIR-спектроскопия, заключается в том, что структура белка и окружающая среда могут быть исследованы с высоким разрешением в твердом состоянии. Для начала поместите 200 миллилитров оксида дейтерия в нижний отсек влагопоглотителя и добавьте 400 граммов карбоната калия. Дайте ему уравновеситься при пяти градусах Цельсия, чтобы достичь стабильной относительной влажности, близкой к 43%Затем поместите незакрытые флаконы, содержащие лиофилизированный белок, в верхний отсек влагопоглотителя, запечатайте влагопоглотитель и инкубируйте при пяти градусах Цельсия.

Чтобы инициировать реакцию обмена дейтерия водорода для сбора образца, сразу после извлечения из осушителя укупорьте флакон и затем погасите реакцию путем мгновенной заморозки флакона и жидкого азота. Храните флакон при температуре минус 80 градусов Цельсия до масс-спектрометрического анализа. Используйте масс-спектрометрию высокого разрешения для анализа образцов, чтобы свести к минимуму обратный обмен.

Как устроена жидкостная хроматографическая система в холодильной камере? Чтобы сначала настроить прибор, подключите контур отбора проб и белковую ловушку к клапану, который контролирует процессы обессоливания и элюирования. Затем откалибруйте систему, введя смесь для настройки низкой концентрации в масс-спектрометр и установив диапазон отношения массы к заряду от 200 до 3,200.

Затем охладите холодильную систему до стабильной рабочей температуры около нуля градусов по Цельсию. Приготовьте в воде закалочный буфер, содержащий 0,2% муравьиной кислоты и 5% метанола, и охладите его на льду. После переноса образцов в жидкий азот осторожно извлеките флакон и восстановите образец, добавив два миллилитра буфера для гашения.

Далее загрузите соответствующий метод ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Чтобы проанализировать образец здесь, обессолите 20 пикомолев миоглобина в белковой ловушке в течение 1,7 минуты с 5% ацетилнитрила и 0,1% муравьиной кислоты. Затем разбавьте белок в течение 3,3 минуты градиентом, увеличивая до 80% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты.

Введите образец и соберите масс-спектры в диапазоне от 200 до 3, 200 отношения массы к заряду. Чтобы определить массу интактного белка в качестве эталона, используйте тот же метод с образцом белка с чрезмерно оцененным белком. Получение массы белка путем деконволюции исходных спектров с помощью программного обеспечения для анализа данных Для анализа образцов миоглобина установите диапазон масс от 15 до 18, килодальтоны, массовое разрешение с точностью до одного Дальтона, а пиковый воздушный змей равным 90%. Для пептидного анализа подготовьте образцы по тому же протоколу, что и для интактных белков.

Когда образцы будут готовы к анализу, подсоедините иммобилизованную пепиновую колонку и аналитическую колонку к клапану и замените белковую ловушку пептидной ловушкой. Калибровка системы на пептиды выполнена для интактных белков, но при установке соотношения массы к заряду в диапазоне от 100 до 1700, после чего охлаждается охлаждаемая система до стабильной рабочей температуры около нуля градусов. После калибровки системы запрограммируйте соответствующий метод ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

Здесь расщепляют 20 пикомолев миоглобина на пепиновой колонке с 0,1%-ной муравьиной кислотой в воде, программируют метод улавливания и обессоливания пептидов в пептидной ловушке в течение 1,7 минуты с 10%-ным ацетилнитрилом и 0,1%-ной муравьиной кислотой, а также элюируют пептиды за четыре минуты с градентом, увеличивающимся до 60%ацетилнитрила и 0,1%-ной муравьиной кислоты. Затем введите образец и соберите масс-спектры в диапазоне отношения массы к заряду от 100 до 1700. Проанализируйте недатированный образец пептида с помощью тандемной масс-спектрометрии для идентификации пептических фрагментов.

Затем перепроверьте экспериментально определенный фрагмент с предсказанными массами, сгенерированными программным обеспечением. Далее установите пороговое значение массы на 10 частей на миллион, чтобы исключить массы с высокой погрешностью для пептидов со спичками. Обратите внимание на состояние заряда пептидной последовательности и время удержания.

Используйте собранные данные о пептидах для расчета среднего количества дейтеро, включенных в пептический фрагмент Используя программное обеспечение для анализа данных Сначала лиофилизируйте белок с помощью вспомогательного вещества и люцина, как указано в текстовом протоколе. После подготовки образцов включите УФ-сшиватель, содержащий 365-нанометровые УФ-лампы. Дайте лампам нагреться в течение пяти минут.

Как только лампы нагреются, выключите их и поместите незакрытые флаконы с составом внутрь камеры сшивающего агента. Облучайте образцы ультрафиолетовым светом в течение 40 минут и включайте образцы без фотолейцина в качестве контроля После облучения крышку и храните флаконы при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия до масс-спектрометрического анализа. Подготовьте образцы к анализу, добавив дистиллированную воду масс-спектрометрического качества, чтобы получить конечную концентрацию белка в два микромоляра.

Затем проанализируйте образцы с помощью того же метода масс-спектрометрии, что и для интактных дейтерированных белков. Но не используйте охлаждаемую систему LC. Получение данных масс-спектрометрии для образца немеченного белка для определения нативной массы белка.

Проводите анализ данных как для образцов DERATED для анализа уровня пептидов. Во-первых, выполните твердотельное фотолитическое мечение интактными белками и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем восстановите образец с помощью 100 миллимолярного буфера бикарбоната аммония, чтобы получить конечную концентрацию белка 10 микромоляров.

Смешайте образец с трипсином в соотношении белка к трипсину 10 к одному моляру и инкубируйте эту смесь при температуре 60 градусов Цельсия в течение 16 часов. Тем временем подсоедините контур отбора проб, пептидную ловушку и аналитическую колонку к клапану системы ВЭЖХ. После расщепления белка погасите реакцию, добавив 0,1% муравьиной кислоты в воду, чтобы получить конечную концентрацию белка в два микромоляра.

Затем запрограммируйте систему с помощью методов ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Здесь вводят и обессоливают 20 пикомолев расщепленного миоглобина в пептидную ловушку в течение 1,5 минут с 5% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты, элюируют пептиды, увеличивая градиент в течение 22 минут до 55% ацетилнитрила и собирают масс-спектры в диапазоне от 100 до 1700 масс к заряду. Используйте онлайн-инструмент для расчета теоретической массы пептида.

Фотография лейцинового аддуктов с номерами фотолейцина, ранее полученными из анализа интактного белка. Включите не менее четырех пропущенных декольте. Создайте массовый список в Excel для пептидной фотографии лейцина аддукта.

Затем сопоставьте теоретический список масс с экспериментально наблюдаемыми массами, установив точку отсечения для идентификации масс с низкой погрешностью. При обмене дейтерия водорода разворачивание белка позволяет замещать водород на дейтериевый белки, которые сохраняют свою структуру и менее склонны к обмену дейтерия. Когда твердотельный водород дейтериевый обменный масс-спектрометрия был проведен на составах, содержащих талозу и сорбит, содержащий миоглобин, состав, содержащий сорбит, показал на 46% большее поглощение дейтерия, что позволяет предположить, что структура миоглобина в сорбите более возмущена во время литического процесса.

Фото лейциновых поперечных ссылок на доступные аминокислоты боковые цепи. Твердотельный фотолитический масс-спектрометрический анализ сорбита и TLO, содержащих миоглобины, показал большее поглощение фотоэйна в составе TLO, чем его аналог. Это говорит о том, что боковые цепи оставались доступными в формулировке TLO.

Как водородный дейтериевый обмен, так и литическое мечение используют коммерчески доступные области и легкодоступные приборы для МС для характеристики белков в твердом состоянии для любой конкретной формулы. Общее время от подготовки образца до полного анализа данных составляет менее двух недель. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить информацию с высоким разрешением о структуре белка и его важности в разработке стабильных лиофилизированных белковых составов.