Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать трехмерный эквивалент кожи полной толщины, который напоминает естественную кожу, и создать точные и воспроизводимые раны в стерильных условиях с помощью автоматизированного устройства для нанесения ран. Это достигается путем предварительного встраивания первичных дермальных фибробластов человека в коллагеновый гидрогель. Затем первичные эпидермальные кератиноциты человека располагаются на верхней части гидрогеля, покрытого фибронектином.

Затем модель культивируется в погруженных условиях, а затем на границе раздела воздушной жидкости формируется трехмерный эквивалент кожи полной толщины, состоящий из дермального компонента и многослойного эпидермиса. Наконец, в стерильной среде создается стандартизированная рана. В конечном счете, иммуногистохимическое окрашивание и микроскопия используются для оценки гистологической структуры эквивалента кожи раненого на всю толщину.

Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как животные модели, например, заключается в том, что эквивалент кожи полной толщины состоит из первичных клеток человека. Таким образом, вместе с автоматическим устройством для нанесения ран мы можем создавать стандартизированные раны, поэтому автоматизированное устройство для нанесения ран может дать представление о процессах заживления кожных ран в гуманизированной среде. Он также может быть применен в наших системах, таких как инженерия костной ткани.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы заживления ран, такие как биологические процессы, восстановление основной кожи и клеточные перекрестные помехи между эпидермальным и дермальным компонентами. Для начала растворите коллаген с 0,1% уксусной кислотой до конечной концентрации шесть миллиграмм на миллилитр. Приготовьте раствор для нейтрализации геля, смешав 232,5 миллилитров двух X dmm, 7,5 миллилитров FCS, 7,5 миллилитров трех молярных hees и 2,5 миллилитров пяти миллиграммов на миллилитр.

Хондроитин сульфат помещают в лунки 24-луночного планшета, отделяют дермальные фибробласты человека или HDFS и центрифугируют клеточные суспензии в течение пяти минут. При 270 G подсчитайте клетки и центрифугируйте Eloqua с концентрацией 1 200 000 HDF в течение пяти минут. При 270 G удалите снат и используйте четыре миллилитра охлажденного раствора для нейтрализации геля, чтобы осторожно ресуспендировать HDF, не вызывая образования пузырьков воздуха.

Затем повторно суспендируйте раствор восемью миллилитрами раствора коллагена. Далее с помощью многоступенчатой пипетки добавьте в каждую вставку по 500 микролитров смеси коллагеновых клеток. В 24-луночной пластине инкубируйте гели в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы дать гелям застыть.

Затем используйте два миллилитра цифрового мультиметра плюс 10% FCS на лунку. Чтобы погрузить гели, инкубируйте гели в течение 24 часов. Используйте сверхчистую воду для растворения белка фибронектина человека до конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр.

После инкубации дермальных эквивалентных гелей в течение 24 часов удалите среду. Используйте 25 микролитров раствора фибронектина, чтобы покрыть каждый дермальный эквивалент, и инкубируйте гели в течение 30 минут. В то же время ресуспендируйте эпидермальные и кератиноциты человека или ГКС с помощью кгм плюс 5% FCS до конечной концентрации 1 миллион клеток на литр семени, по 100 000 геков поверх каждого геля.

Затем инкубируйте гели в течение 45 минут, чтобы дать возможность клеткам прилипнуть, используя два готовых плюс 5% FCS, погрузите клетки в воду и продолжайте инкубацию. После инкубации в течение двух-трех дней замените среду на 2% FCS, а затем замените среду без FCS, через два-три дня. На седьмой день полностью удалите среду.

С помощью стерильных щипцов поместите каждый вкладыш в одну лунку из шестилуночного планшета. Затем добавьте 1,5 миллилитра аэролифтной среды на лунку. Следите за тем, чтобы не намочить поверхность FTSC.

Меняйте носитель каждые два-три дня еще на 14 дней. Подготовьте автоматическое устройство для нанесения ран, используя 70% этанол и ультрафиолетовое излучение для дезинфекции рабочей зоны с помощью стерильных щипцов. Поместите эквиваленты кожи в определенные области несущей пластины автоклава для образцов.

Поместите опорную пластину для образца в гнездо под сверлильной головкой. С помощью управляющего программного обеспечения установите параметры ранения следующим образом. Скорость отжима 15 000 об/мин проникания, 1,5 миллиметра.

Силовая установка 100 Гц. Передайте параметры ранения в автоматизированное устройство для раны. Приступайте к процедуре ранования, когда она будет завершена.

Извлеките несущую пластину для образца из гнезда и с помощью стерильных щипцов перенесите раненый FTSE обратно во вкладыш, используемый для культивирования. Инкубируйте раненого FTSE до экспериментальной оценки. Используйте модели для его гистологического анализа в любое время.

Выделенные HDFS и HKS характеризовались иммуногистохимическим окрашиванием перед использованием их для FTSE. HDF положительны на ментон, маркер первичной фибробласты HEK с высокой экспрессией белка ранней дифференцировки ЦИТОКЕРАТИН 14, но почти не экспрессирует белок поздней дифференцировки кератиноцитов ЦИТОКЕРАТИН 10. FTSE культивировали в течение семи дней в условиях погруженной среды, а затем 14 дней на границе раздела воздушной жидкости.

В ходе этого процесса FTSC значительно сокращается в течение 21 дня. HEK распространяются за счет изменения уровня среды таким образом, что поверхность моделей подвергается воздействию воздуха. А за счет увеличения концентрации кальция HKS стимулируются к дифференцировке в многоклеточный эпидермис, состоящий из нескольких жизненно важных клеточных слоев кератиноцитов.

При разных состояниях дифференцировки D и роговицы предсердий. Сравнивая окрашивание гематином и эозином FTSE с естественной кожей человека, становится очевидным, что FTSE имитируют гистологическую архитектуру кожи. HDF в гидрогеле collagen one может быть окрашен первичными антителами против виментина.

Кроме того, кератиноциты образуют эпидермальный слой, состоящий из цитокератин-14положительных клеток и маркера поздней дифференцировки. ЦИТОКЕРАТИН 10 экспрессируется в супербазальных слоях. Кроме того, St.Stratum cornium положительен на RIN после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области дерматологии к изучению заживления кожных ран и стандартизированной установке in vitro, которая точно имитирует человеческую кожу.