Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии

Общей целью данной процедуры является анализ синусоидального эндотелия печени. Это достигается путем первичной изоляции печени и перфузии ее с помощью фиксатора. Затем печень разрезается на блоки и обезвоживается для подготовки к электронной микроскопии.

Затем образцы печени покрываются напылением и исследуются под электронным микроскопом. Наконец, анализируются электронные микрофотографии и рассчитываются диаметр и частота остеклений, а также процент пористости. В конечном счете, электронная микроскопия используется для отображения изменений в синусоидальном эндотелии печени при различных условиях.

Этот метод дает нам представление об ультраструктуре и морфологии кровеносных сосудов печени в их эндотелии. Он также может быть использован для обследования почек и мозга таким же образом: все процедуры с использованием животных проводятся в соответствии с местным законодательством. Эта работа одобрена Комитетом по защите животных местного округа здравоохранения Сиднея.

Разрешенные процедуры описаны в лицензионной документации по проекту и соответствуют рекомендациям, обеспечивающим благополучие животного в любое время. Это операция, не требующая выживания. После приготовления фиксатора, согласно текстовому протоколу, прогрейте перфузионный буфер и фиксатор при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия.

После того, как животное обезболито одной внутрибрюшинной инъекцией кетамина и ксилазина, оцените уровень седативного эффекта путем отведения задних конечностей и защемления хвоста. Затем ножницами с тупым концом сделайте Y-образный разрез в брюшной полости животного, чтобы обнажить печень и воротную вену. Затем завяжите два очень слабых шва вокруг воротной вены, один проксимальнее к печени, а другой более дистально к печени.

Канюляция воротной вены с помощью капельницы соответствующего размера. Затем затяните швы, чтобы зафиксировать канюлю. Теперь используя от пяти до 20 миллилитров PBS, подогретых до 37 градусов по Цельсию, начинают перфузию под давлением 10 сантиметров H2O.

Избегайте попадания пузырьков воздуха в печень, которые могут привести к образованию артефактов, и слишком высокого давления воздуха, которое может повредить печень, разорвать ЦВА брюшной и грудной пол, чтобы буфер мог свободно выйти из печени. Это предотвращает высокое противодавление, повреждение печени, синусоидальных и эндотелиальных клеток или LCC. Как только печень освободится от крови, замените PBS на электронную микроскопию или ЭМ, фиксирующую и перфузирую, пока печень не затвердеет и не станет очень бледной.

Примерно пять минут. Затем с помощью скальпеля разрежьте печень на один-два кубических миллиметра. Используйте фиксатор em для публикации.

Зафиксируйте ткань при температуре четыре градуса Цельсия на срок от 24 до 72 часов. Затем перенесите ткань в 0,1 молярный буфер натрия Кейта и храните при температуре четыре градуса Цельсия до 12 месяцев, чтобы установить образцы для сканирующей электронной микроскопии или СЭМ. После обезвоживания образцов в соответствии с текстовым протоколом промаркируйте основание металлических заглушек СЭМ и наклейте двустороннюю углеродную ленту на верхнюю часть заглушек под препарирующим микроскопом, визуализируйте образцы для выявления поверхности с лучшими синусоидами для СЭМ.

Шнурок, выбранная поверхность должна быть обращена вверх на поверхность копилка и прочно приклеить его к корешку. После выполнения нанесения покрытия методом распыления и SEM в соответствии с текстовым протоколом откройте изображение на изображении J и с помощью масштабной линейки, встроенной в изображение, установите масштаб с помощью инструмента «Многоугольник» на изображении J Трассировка вокруг всей плоской области LSEC, включая фенестрированные и фенестрированные области, исключите любые крупные фрагменты мусора, которые находятся на поверхности ячейки и могут закрывать фенестрации. Чтобы измерить диаметр остекления, проведите линию по наибольшему диаметру каждого остекления, выбрав инструмент «Линия».

Нажмите M, чтобы измерить линию, и D, чтобы навсегда нарисовать линию на рисунке. Эта линия определена как диаметр остекления и теперь будет доступна в окне результатов на изображении J. Измерьте все зазоры, которые представляют собой большие отверстия в цитоплазме LSEC более 250 нанометров, а также фенестрации. Рассчитайте площадь промежутков, которые не являются круглыми, обводя их вокруг и используя изображение J, чтобы вычислить их площадь за пределами данных из поля результатов на изображении J в электронную таблицу Excel.

Для дальнейшего анализа используйте следующие формулы для проведения расчетов остекления. Средний диаметр остекления равен среднему значению всех диаметров остекления. Площадь остекления равна pi r в квадрате, где R вычисляется из отдельных диаметров остекления.

Процент пористости равен сигма пи R в квадрате по общей анализируемой площади и микронам, умноженным на 100, исключает из этого расчета сумму промежутков. Для представления данных в публикациях укажите диаметр остекления с утверждением, подтверждающим, что для определения остекления использовались граничные диаметры, частоту и пористость остекления, а также утверждение, подтверждающее, были ли зазоры включены в анализ, и график распределения частот диаметра остекления и количества блоков печени, а также изображения. При малом увеличении с помощью СЭМ видна плоская поверхность образца печени с открытой площадью, достаточно большой для наблюдения многих крупных сосудов печени и синусоид, включая портальный тракт, и центральную ЭС, как показано здесь.

Обеспечение правильного размещения печеночной блокады на монтажном стержне имеет важное значение для получения четких изображений синусоид, и следует избегать капсулы глистена, которая покрывает все детали синусоид печени. По этой причине, как показано здесь, большее увеличение позволяет наблюдать остекления LSEC. Пластинки гепатоцитов могут выглядеть как кровеносные сосуды, но такие особенности, как BLI, помогают ориентироваться.

Этот рисунок демонстрирует, что высокое давление обильности может вызывать такие артефакты, как большие промежутки в эндотелии, которые, как считается, вызваны слиянием пластин LSEC SIV, которые легко идентифицируются под SEM, избегая клеточной мембраны непосредственно над ядрами, которая может быть видна как выпуклость под поверхностью LSEC, что поможет с точностью расчетов плотности и пористости фенестрации. Наконец, количественная оценка плотности и частоты диаметра остекления LSEC обеспечивает эмпирическое измерение остекления и позволяет измерять изменения, вызванные болезнями старения, токсинами или методами лечения. После процедуры перфузии ткань может быть обработана для других методов, таких как просвечивающая электронная микроскопия, чтобы посмотреть на клеточную ультраструктуру, митохондриальную структуру.

Его также можно использовать для гистологии.