Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии
30 апреля 2015 г.
Фенестрированная синусоидальная эндотелиальная клетка печени является биологически важной системой фильтрации, на которую сильно влияют различные заболевания, токсины и физиологические состояния. Эти изменения существенно влияют на функцию печени. Описаны методы стандартизации измерения размера и количества остеклений в этих ячейках.
Общая цель данной процедуры заключается в анализе синусоидального эндотелия печени. Для этого сначала изолируют печень и перфузируют ее фиксатором. Затем печень разрезают на блоки и подвергают дегидратации для подготовки к электронной микроскопии.
Затем образцы печени подвергаются напылению и исследуются с помощью электронного микроскопа. В завершение проводится анализ электронных микрофотографий, при этом рассчитываются диаметр и частота фенестраций, а также процент пористости. В конечном итоге электронная микроскопия используется для демонстрации изменений в синусоидальном эндотелии печени при различных условиях.
Данный метод позволяет изучить ультраструктуру и морфологию эндотелия кровеносных сосудов печени. Аналогичным образом его можно использовать для исследования почек и головного мозга. Все процедуры с использованием животных проводятся в соответствии с местным законодательством. Данная работа одобрена Комитетом по благополучию животных местного округа здравоохранения Сиднея.
Разрешенные процедуры описаны в документации к лицензии проекта и соответствуют руководствам, обеспечивающим благополучие животного на всех этапах. Данная операция является невыживательной. После приготовления фиксатора согласно текстовому протоколу подогрейте перфузионный буфер и фиксатор до 35–37 °C.
После того как животное будет анестезировано однократной внутрибрюшинной инъекцией кетамина и ксилазина, оцените уровень седации по рефлексу отдергивания задней конечности и зажиму хвоста. Затем с помощью ножниц с тупыми концами сделайте Y-образный разрез в брюшной полости животного, чтобы обнажить печень и воротную вену. После этого наложите две очень свободные лигатуры на воротную вену: одну проксимальнее печени, другую — дистальнее.
Катетеризируйте воротную вену, используя внутривенный катетер подходящего размера. Затем затяните швы, чтобы зафиксировать катетер. Теперь, используя от 5 до 20 мл PBS, подогретого до 37 °C, начните перфузию при давлении 10 см H2O.
Не допускайте попадания пузырьков воздуха в печень, так как это приведет к появлению артефактов и созданию избыточного давления воздуха, что повредит орган; перережьте брюшную и грудную полые вены, чтобы буфер мог свободно выходить из печени. Это предотвратит возникновение высокого обратного давления, повреждение печени, синусоидальных и эндотелиальных клеток или LCCs. Как только кровь будет полностью вымыта из печени, замените PBS на фиксатор для электронной микроскопии (em) и проводите перфузию до тех пор, пока печень не станет плотной и очень бледной.
Примерно пять минут. Затем с помощью скальпеля разрежьте печень на блоки размером от одного до двух кубических миллиметров. Используйте фиксатор для последующей фиксации.
Фиксируйте ткань при температуре 4 °C в течение 24–72 часов. Затем перенесите ткань в 0,1 М натрий-катехолевый буфер и храните при температуре 4 °C до 12 месяцев для последующего монтажа образцов для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). После дегидратации образцов согласно текстовому протоколу промаркируйте основание металлических держателей для СЭМ и с помощью диссекционного микроскопа нанесите двустороннюю углеродную ленту на верхнюю часть держателей; осмотрите образцы, чтобы определить поверхность с наиболее выраженными синусоидами для СЭМ.
Поместите кружево выбранной стороной вверх на поверхность углеродной ленты заглушки и плотно прижмите его к ней. После проведения напыления и СЭМ в соответствии с текстовым протоколом откройте изображение в ImageJ и, используя встроенную в снимок масштабную линейку, установите масштаб. С помощью инструмента «многоугольник» (polygon tool) в ImageJ обведите всю плоскую область LSEC, включая фенестрированные и нефенестрированные участки, исключая любые крупные частицы мусора на поверхности клетки, которые могут закрывать фенестры. Для измерения диаметра фенестр выберите инструмент «линия» (line tool) и проведите линию через наибольший диаметр каждой фенестры.
Нажмите M, чтобы измерить линию, и D, чтобы навсегда нарисовать линию на изображении. Эта линия определяется как диаметр фенестры и теперь будет доступна в окне результатов Image J. Измерьте все зазоры, представляющие собой более крупные отверстия в цитоплазме LSEC размером более 250 nanometers, а также фенестры. Вычислите площадь зазоров, которые не имеют круглой формы, обводя их контуры и используя Image J для расчета их площади, после чего перенесите данные из окна результатов Image J в таблицу Excel.
Для дальнейшего анализа используйте следующие формулы для расчета параметров фенестрации. Средний диаметр фенестрации равен среднему значению всех диаметров фенестраций. Площадь фенестрации равна πr², где R рассчитывается на основе индивидуальных диаметров фенестраций.
Процент пористости равен σπR² деленной на общую проанализированную площадь в микрон² и умноженной на 100; исключите из этого расчета суммарную площадь щелей. Для представления данных в публикациях укажите диаметр фенестраций вместе с заявлением, подтверждающим, что для определения фенестраций использовались граничные диаметры, а также частоту фенестраций и пористость; кроме того, включите заявление о том, учитывались ли щели в анализе, график частотного распределения диаметра фенестраций и количество блоков печени, а также изображения. При малом увеличении с помощью СЭМ видна плоская поверхность образца печени с открытой областью, достаточно большой для наблюдения за множеством крупных сосудов и синусоидов печени, включая портальный тракт и центральную вену, как показано здесь.
Правильное размещение блока печени на монтажном штифте имеет решающее значение для получения четких изображений синусоидов; при этом следует избегать перекрытия деталей синусоидов печени блестящей капсулой. По этой причине, как показано здесь, большее увеличение позволяет наблюдать фенестрации LSEC. Пластинки гепатоцитов могут быть похожи на кровеносные сосуды, но такие признаки, как BLI, помогают в ориентации.
На этом рисунке показано, что высокое давление перфузии может привести к возникновению артефактов, таких как широкие разрывы в эндотелии, которые, вероятно, вызваны слиянием сивулярных пластинок (SIV) LSEC; такие артефакты легко идентифицируются при сканирующей электронной микроскопии (SEM). Избегание участков клеточной мембраны непосредственно над ядрами, которые могут выглядеть как выступы под поверхностью LSEC, поможет повысить точность расчетов плотности и пористости фенестраций. Наконец, количественная оценка диаметра, плотности и частоты фенестраций LSEC обеспечивает эмпирическое измерение фенестраций и позволяет оценивать изменения, вызванные старением, заболеваниями, воздействием токсинов или терапией. После процедуры перфузии ткань можно подготовить для других методов анализа, таких как просвечивающая электронная микроскопия, для изучения ультраструктуры клеток и структуры митохондрий.
Метод также может быть использован для гистологического исследования.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описан стандартизированный протокол анализа морфологии синусоидальных эндотелиальных клеток печени (LSECs) с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Этот метод позволяет точно измерять размер, частоту и пористость фенестр, что имеет критическое значение для понимания того, как физиологические, патологические и фармакологические факторы влияют на функцию печени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология печени
- Клеточная морфология
- Электронная микроскопия
Теоретические основы
- LSEC обладают трансцеллюлярными фенестрами, которые облегчают транспорт веществ из крови в паренхиму печени.
- Фенестрации динамичны; их размер и количество могут изменяться в зависимости от заболевания, приема лекарственных препаратов или физиологического состояния.
- Точная количественная оценка фенестраций имеет важное значение для изучения функции и патологии печени.
- Для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости результатов различных исследований необходимы стандартизированные протоколы визуализации и анализа.
Цель исследования
- Предоставить воспроизводимый протокол фиксации, подготовки и СЭМ-анализа LSECs.
- Обеспечить точное измерение диаметра, частоты и пористости фенестраций.
- Облегчить изучение морфологических изменений LSEC при различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- Перфузионная фиксация печени с использованием подогретых буферов и фиксаторов.
- Диссекция и нарезка ткани печени на небольшие блоки.
- Обезвоживание, монтаж и напыление образцов для СЭМ.
- СЭМ-визуализация при различных увеличениях для изучения фенестраций LSEC.
- Количественный анализ изображений с помощью ImageJ для измерения диаметра, частоты и процента пористости фенестраций.
Основные результаты
- СЭМ позволяет четко визуализировать фенестрации LSEC и структуры печеночных синусоидов.
- Правильное перфузионное давление и бережное обращение с тканями имеют решающее значение для предотвращения артефактов, таких как искусственные зазоры.
- Количественный анализ дает эмпирические данные о диаметре, плотности и пористости фенестраций.
- Данный протокол позволяет выявлять морфологические изменения LSEC, вызванные старением, заболеваниями, воздействием токсинов или терапией.
Выводы
- Данный стандартизированный протокол СЭМ обеспечивает надежное и воспроизводимое измерение фенестраций LSEC.
- Точный морфологический анализ служит основой для исследований функций и патологий печени.
- Метод может быть адаптирован для анализа других органов, таких как почки и мозг.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководителей
Точный количественный анализ фенестр синусоидальных эндотелиальных клеток печени позволяет снизить механистические риски при оценке гепатотоксичности и валидации мишеней метаболических заболеваний. Стандартизированный анализ на основе СЭМ обеспечивает прогностическую достоверность при оценке индуцированных соединениями эндотелиальных изменений, что помогает принимать ранние решения о целесообразности дальнейшей разработки в пайплайнах поиска новых лекарств. Данный метод улучшает трансляционную преемственность, связывая ультраструктурные фенотипы с показателями функции печени в доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки диаметра, частоты и пористости фенестраций как функциональных показателей фенотипа LSEC.
- Практическая ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет воспроизводимой ультраструктурной оценки механизмов эндотелиальной проницаемости.
- Влияние на портфель разработок: Повышает достоверность прогнозирования при выборе мишени путем установления связи между динамикой фенестраций и физиологическими состояниями, соответствующими патологии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем установления базовых показателей фенестрации.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет фиксированных протоколов перфузии, фиксации и анализа изображений.
- Стратегическая ценность: Подтверждение готовности к скринингу с помощью количественных данных, полученных с помощью СЭМ, которые подходят для высококонтентного фенотипирования эндотелия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Рассматривается значимость для изучения заболеваний посредством выявления изменений фенестрации в ответ на воздействие токсинов, старение или патологические состояния.
- Операционная ценность: Описывается преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации с помощью согласованного морфометрического анализа LSEC.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении разработки, предоставляя эмпирические данные о целостности эндотелия в экспериментальных условиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Определяет место метода в континууме открытий — от валидации мишени до доклинической оценки, где целостность эндотелия служит основой для оценки соединений на базе механизмов их действия.
- Открывающая биология: объясняет, как данный метод способствует проверке гипотез, уточнению путей передачи сигналов или снижению биологических рисков с помощью морфометрии фенестрации.
- Скрининг: описывает готовность анализа, воспроизводимость или количественные результаты, если это подтверждено в статье.
- Аналитика: выделяет измерения, показатели или статистические результаты, которые помогают командам сравнивать условия в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: связывает метод с преклинической преемственностью или соответствием биомаркеров только в тех случаях, когда это подтверждено источником.
- Повторное корпоративное использование: представляет метод как многократно используемую возможность, а не как разовую технику.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности при оценке функции эндотелия.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов фенотипирования LSEC.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях в программах, нацеленных на печень.
- Влияние на портфель: Приоритезация и решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных изменений эндотелия.
Особенности реализации
- Необходимый научный опыт в области подготовки образцов для электронной микроскопии и морфометрического анализа.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая СЭМ, напылитель и программное обеспечение для анализа изображений.
- Требования к межкомандной стандартизации протоколов фиксации, дегидратации и визуализации в разных лабораториях.
- Особенности адаптации для различных модельных систем, таких как эндотелий почек и головного мозга, как указано в источнике.
- Практические ограничения, подтвержденные исходными материалами, включая предотвращение появления артефактов из-за давления при перфузии и правильную ориентацию образца.
