Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Цель настоящего Протокола заключается в идентификации населения лимфатический эндотелиальных клеток в печени с помощью описанных маркеров. Мы используем коллагеназы IV и DNase и нежный мясорубки ткани, в сочетании с проточной цитометрии, чтобы определить собственный населения лимфатический эндотелиальных клеток.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в лимфатических и печеночных областях, таких как лимфатические эндотелиальные клетки, или LECs, реагировать на конкретные раздражители и как это способствует болезни патогенеза. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем оценить фенотип лимфатической эндотелиальной клетки печени и функционировать на основе клетки, и может быть использован для вниз потока приложений после сортировки клеток. Хотя этот метод может обеспечить понимание лимфатической биологии печени, он также может быть использован для оценки лимфатических эндотелиальных клеток из различных тканей, таких как кожа и молочная железа.

Демонстрацией процедуры будет Джеффри Финлон, профессиональный научный сотрудник из моей лаборатории. Чтобы подготовить одноклеточную суспензию из изолированных клеток печени, начните с распыления мыши с семидесятипроцентного этанола, и обеспечение лапы к вскрытию борту. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы сократить кожу примерно на один сантиметр выше ануса и использовать зубчатые типсы, чтобы поднять кожу от тела.

Вставьте ножницы советы между кожей и брюшной полости и открыть ножницы, чтобы отделить ткани, прежде чем продолжить разрез кожи до шеи. Защитите кожу до доски для вскрытия под каждым forelimb и выше каждого заднего лапы, и потяните брюшной мешок вверх, чтобы продлить разрез к шее. Возьмитесь за доли печени и вырезать чуть ниже грудины, чтобы вскрытие вокруг печени.

Затем перенесите орган в четыре миллилитров среды EHAA Click. Используйте скальпель, чтобы разрезать печень примерно на кусочки диаметром около одного миллиметра и переварить кусочки в пятистах микролитров свежеприготовленного раствора пищеварения и пятисот микролитров DNase 1. После пятнадцати минут при 37 градусах по Цельсию используйте пятисот миллилитровую трубу, чтобы тщательно перемешать ткани и вернуть контейнер в инкубатор еще на пятнадцать минут.

В конце инкубации перенесите переваренный образец через сто микрон-ситечко в пятидесятимилитровую коническую трубку и используйте поршень из одного миллилитрового шприца, чтобы аккуратно нажать на оставшиеся кусочки ткани через сетку. Вымойте фильтр пятью миллилитров буфера изоляции и осторожно нажмите все оставшиеся ткани через ситечко. Соберите изолированные клетки печени путем центрифугации и повторно приостановить гранулы в четырех миллилитров буфера лиза красных кровяных телец.

После пяти минут при комнатной температуре, мыть клетки в десять миллилитров буфера изоляции и рассчитывать клетки на гемоцитометре, чтобы определить полное количество печени. Повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров двадцать процентов йодиксанола и наложить подвеску клетки с одним миллилитром PBS. Разделит клетки по плотности градиентного разделения и урожай слой между PBS и йодиксанол.

Затем процедите клетки через сто микрометровый ситечко в новую пятидесятимильную коническую трубку. Вымойте клетки в десять миллилитров свежего буфера изоляции и повторно приостановить в результате гранулы в пятьсот микролитров PBS, дополненный двухпроцентной сыворотки крупного рогатого скота плода, или FBS. После подсчета, aliquot примерно пять раз десять шестой не-паренхимальных клеток в каждом контроле и экспериментальной хорошо девяносто шесть пластины хорошо для центрифугации и повторно приостановить гранулы в девяносто микролитров PBS плюс FBS на колодец.

Добавьте соответствующие экспериментальные и контролировать первичные антитела коктейли для каждой скважины и пятно всех скважин с соответствующим маркером жизнеспособности. Наиболее важным шагом в этой процедуре является надлежащее titration антител и использование контроля типа льда и флуоресценции-1 контроля для проверки окрашивания. После тридцати минут при четырех градусах по Цельсию центрифуга моет клетки стою микролитров PBS плюс FBS на колодец и передают клетки из каждого хорошо в отдельные пятими миллилитровые цитометрические трубки круглого дна до четырехсот микролитрового конечного объема PBS плюс FBS на трубку.

Затем используйте небольшой объем клеток для регулировки параметров лазера и компенсации на цитометре потока и считыв все события для каждой трубки. Когда все трубки были прочитаны, импортировать данные в соответствующую программу цитометрии потока. Ворота на живых клетках на основе красителя маркера жизнеспособности, где негативное выражение считается живым.

Ворота на живые клетки на основе размера и детализации клеток, а также их жизнеспособность маркер красителя выражение, а затем gating на CD45 отрицательной CD31 положительной популяции клеток с использованием соответствующих изотипа контроля и флуоресценции-1 данных для определения положительных и отрицательных популяций. Затем ворота CD45 отрицательных CD31 положительные клетки в соответствии с их CD16/32 и podoplanin выражение, чтобы позволить идентификацию CD45 отрицательный CD31 положительный, CD16/32 отрицательный podoplanin положительный лимфатический эндотелиальный, и CD45 отрицательный CD31 положительные, CD16/32 положительный podoplanin отрицательной печени синусоидальной эндотелиальной популяции. Emphatic endothelial клетки выражают лимфатический сосуд и endothelial hyaluronan одно, но не CD146.

Печень изолированных CD31 положительные CD16/32 положительные клетки изолированы, как попродемонстрировано, также CD146 положительный и подопланин положительный, в то время как CD31 положительные CD16/32 отрицательные клетки в первую очередь CD146 отрицательный и либо подопланин положительный или отрицательный. Позитивность определялась на основе окрашивания флуоресценции-1. Лимфатические эндотелиальные клетки печени CD146 отрицательные и PDPN положительные.

Ни сосудистый эндотелий, ни макрофаги печени мурина не выражают подопланин. Podoplanin окрашивание также может быть использовано для различения холангиоцитов от лимфатических сосудов на основе различных ядерных структур желчных протоков, а также цитокератин 7 окрашивания. Как только лимфатические эндотелиальные клетки совместно выразить сосудистых эндотелиальных рецепторов фактора роста 3 и Просперо homeobox белка 1 в печени, эти маркеры могут быть дополнительно использованы для подтверждения чистоты отсортированы печени лимфатической эндотелиальной популяции клеток.

При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать быстро и держать клетки на льду. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сортировка потоков популяций LEC, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как транскрипционные профилирования LEC. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области печени конкретных лимфатической биологии, чтобы изучить, как лимфатические воздействия болезни печени у мышей и людей.

Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, потому что лимфатические эндотелиальные клетки являются редкими, постепенная популяция в печени и метод должен быть выполнен быстро.