Очистка гепатоцитов и синусоидальных эндотелиальных клеток от мыши печени перфузии

Общая цель этой процедуры заключается в проведении успешной перфузии печени мыши, чтобы облегчить очистку определенных популяций клеток печени, представляющих интерес. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гепатологии о том, как помочь функциям конкретных популяций клеток печени в анализах in vitro или in vivo. Основным преимуществом данной методики является большое количество гепатоцитов в синусоидальных эндотелиальных клетках, которые можно получить из каждой печени.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как важно увидеть цвет и форму оптимально переваренной печени для сохранения жизнеспособности клеток. Чтобы установить катетер воротной вены, сначала с помощью задней части щипцов переместите кишечник на правую сторону брюшной полости мыши, обнажив воротную вену, и с помощью изогнутых щипцов продеть 20-сантиметровый кусок швейной нити из полиэстера под воротную вену между печенью и верхней панкреатодуоденальной веной. С помощью щипцов осторожно протяните нить на другую сторону животного, так, чтобы она оказалась по центру под воротной веной.

И завяжите свободный верхний узел вокруг воротной вены. Поместите изогнутые щипцы под вену и осторожно потяните весь тканевый материал к хвосту, чтобы выпрямить вену. Далее поместите скос иглы катетера лицевой стороной вверх и параллельно нижней части воротной вены рядом с щипцами, и аккуратно проколите вену иглой.

Когда скос окажется в просвете вены, втяните подпружиненную иглу и продолжайте проталкивать катетер Палмера через вену, пока скос не окажется рядом с разветвленной областью венеры. Закрепив узел вокруг катетера, немедленно установите перистальтический насос на скорость четыре миллиметра в минуту и соедините мужской конец трубки с женским концом катетера, после чего вы должны начать видеть ветвь печени. Разрежьте брюшную аорту для дренирования.

С помощью малярного скотча прикрепите трубку к нижней прокладке. С помощью ножниц разрежьте кожу живота вертикально, чтобы обеспечить дренаж крови и перфузионной жидкости. Затем несколько раз сожмите кровеносный сосуд прямыми щипцами, чтобы надуть печень, убедившись, что вся кровь вытекла, и перфузируйте печень PBS до тех пор, пока ткань печени не побледнеет.

Чтобы собрать гепатоциты, сначала поменяйте трубку оттока из однолитровой колбы PBS на 125-миллилитровую колбу, содержащую второй буфер, дополненный коллагеназой-4. Когда коллагеназа достигнет печени, кратко, но плотно сожмите отходящий кровеносный сосуд, чтобы создать давление и позволить буферу пищеварения заполнить все доли печени. Освободите сосуд до того, как буфер прорвется через соединительную ткань, окружающую печень.

И позвольте буферу перфузировать через печень до тех пор, пока весь объем не пройдет через ткани. Затем поставьте рядом с мышью кристаллизующую чашку, содержащую 10 миллилитров буферной единицы, и с помощью прямых щипцов и ножниц перенесите печень в чашку. Переложите чашку в капюшон для стерильных тканей и с помощью стерильной техники возьмитесь за печень, чтобы снять капсулу.

Аккуратно стряхните клетки с ткани печени, и вылейте полученный клеточный раствор через 100-микронный фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем промойте остатки печени от фильтра более буферным. Когда кажется, что в печени нет клеток, процедите вытянутый фильтрат через 40-микронный фильтр во вторую 50-миллилитровую пробирку и соберите клетки центрифугированием.

Вылейте непаренхиматозную клетку и мертвую надосадочную жидкость, содержащую гепатоциты, в новую 50-миллилитровую пробирку на льду одним движением, чтобы сохранить гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в 40 миллилитрах свежего буфера для следующего центрифугирования. Чтобы изолировать синусоидальные эндотелиальные клетки, центрифугируют надосадочную жидкость, содержащую непаренхиматозные клетки. Соберите клеточные суспензии в одну новую 50-миллилитровую коническую трубку, и доведите общий объем до 35 миллилитров.

Соберите вытянутые клетки центрифугированием и с помощью пипетки объемом 25 миллилитров осторожно перенесите верхние 25 миллилитров надосадочной жидкости, содержащей непаренхиматозные клетки, в новую 50-миллилитровую коническую пробирку со льдом. Добавьте в пробирку 25 миллилитров свежей среды и повторно суспензируйте гранулу для повторного центрифугирования и удаления надосадочной жидкости. Затем центрифугируйте надосадочную жидкость и добавьте 15 миллилитров 50% раствора Percoll в новую 50-миллилитровую пробирку.

Используя пипеттер, установленный на самую низкую скорость выброса, нанесите 20 миллилитров 25% Percoll на 50% раствор Percoll и повторно суспендируйте непаренхиматозные клетки в 10 миллилитрах среды с температурой 4 градусов Цельсия. Аккуратно нанесите клетки слоями на раствор Перколла. И разделите ячейки с помощью центрифугирования с градиентом плотности.

Затем аспирируйте первые 30 миллилитров раствора и с помощью пластиковой пятимиллилитровой пипетки соберите синусоидальный эндотелиальный и клетки Купфера, расположенные на межфазном участке градиента плотности от 25 до 50% раствора, в новую 50-миллилитровую коническую трубку. Промойте клетки 50 миллилитрами среды и повторно суспендируйте гранулу, одновременно промывая боковые стороны дна трубки в 12 миллилитрах теплой среды. Чтобы отделить синусоидальные эндотелиальные клетки от клеток Купфера, перенесите клеточную суспензию в полистирольную чашку Петри в инкубаторе для увлажненных тканей на восемь минут.

В конце инкубации используйте 25-миллилитровую пипетку для аспирации надосадочной жидкости и используйте надосадочную жидкость для ополаскивания чашки с помощью пипеттера, установленного на самой низкой скорости, чтобы собрать оставшиеся синусоидальные эндотелиальные клетки. Затем перенесите синусоидальные эндотелиальные клетки в новую 50-миллилитровую трубку. Затем соберите клетки путем центрифугирования для их повторного суспензирования и помещения в чашки для культивирования клеток, покрытых коллагеном.

Сканирующая электронная микроскопия печени мыши после нестационарной перфузии PBS способом, аналогичным показанному выше, позволяет получить четкое представление о микроанатомии печени и микроворсинках между гепатоцитами. Гепатоциты, собранные во время низких скоростей вращения в начале процедуры, демонстрируют высокую чистоту после четырех промываний в буферах, содержащих бычий сывороточный альбумин. Разделение синусоидальных эндотелиальных клеток путем селективной адгезии на полистирольной чашке Петри, покрытой коллагеном, приводит к чистоте от 83 до 90%, что в значительной степени зависит от общей эффективности расщепления коллагеназы.

Количественные измерения с использованием световой микроскопии в рамках репрезентативной процедуры разделения, как было показано выше, позволяют получить типичные результаты выделения почти 100% чистой популяции гепатоцитов. И чуть более 89% чистой популяции синусоидальных эндотелиальных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как катетизировать воротную вену мыши и как очистить гепатоциты и синусоидальные эндотелиальные клетки печени мыши.

Эта процедура также может быть использована для очистки сателлитных клеток от непаренхиматозной фракции после выделения гепатоцитов с использованием различных градиентов плотности и скоростей центрифугирования.