Кость кондиционированной среды: Подготовка и биопроб

Общая цель этого видео - описать, как приготовить кондиционированную для кости среду и проверить ее активность in vitro. Это достигается путем предварительного забора костной крошки из нижней челюсти свиньи с помощью скребка для костей. Второй шаг заключается в термической обработке, деминерализации или бездействии костной крошки перед ее инкубацией в питательной среде в течение 24 часов.

Затем собирается кондиционированная кость среда, содержащая все факторы, высвобождаемые из костной стружки. Заключительным этапом является стимуляция клеток кондиционированной костью средой или предварительная инкубация биоматериала с кондиционированной средой для кости и семенными клетками на ней после инкубационного периода. В конечном счете, количественная ПЦР в реальном времени используется для отображения изменений в экспрессии генов клеток после лечения.

Использование аутологичных костных трансплантатов отдельно или в сочетании с другими биоматериалами стимулирует регенерацию кости при костных дефектах вокруг имплантата и, таким образом, обеспечивает хорошие долгосрочные результаты. В этом видео представлен биоанализ in vitro, который полезен для определения генетической реакции массовых клеток на биомолекулы в костном состоянии. Medium Bone condition medium может помочь ответить на ключевые вопросы в области челюстно-лицевой и стоматологической травматологии, например, почему аутологичная кость является целью стандартного трансплантата при регенерации кости.

Подготовка кондиционной среды из обработанной кости, такой как термообработанный костный аутотрансплантат или изованный костный матрикс, может быть трудно стандартизировать. Поэтому важно быть точным. Для начала приобретите свежие свиные мандибулы у местного мясника и положите их на твердую поверхность.

Затем используйте надкостницу, чтобы освободить лоскут надкостницы на всю толщину, уделяя особое внимание тому, чтобы не оставить мягкие ткани, прикрепленные к кости. После удаления надкостницы крепко возьмитесь за скребок для кости и длинными движениями собирайте костную стружку с щечной стороны нижней челюсти. Выбросьте любую костяную стружку длиной менее одного миллиметра.

Не допускайте высыхания костной стружки, быстро накрыв ее питательной средой в 10-сантиметровой чашке Петри. После того, как будет собрано достаточное количество костной стружки, приготовьте термоконтрольную партию, пастеризовав пять граммов костной стружки. Пастеризуйте чипсы, нагревая их в течение 30 минут при 80 градусах Цельсия, или автоклавируйте их в течение 20 минут при 121 градусе Цельсия.

Далее приготовьте деминерализованный контроль, добавив пять граммов костной крошки в один молярный раствор соляной кислоты и поместив их на шейкер на четыре-шесть часов при четырех градусах Цельсия. Затем неоднократно промывайте костную стружку питательной средой до достижения нейтрального pH. Поместите по пять граммов свежей костной стружки и по пять граммов каждого из контрольных препаратов в отдельную посуду, и добавьте в каждую посуду по 10 миллилитров свежей питательной среды.

Затем образцы инкубируют во влажной атмосфере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, чтобы на следующий день создать кондиционированную среду. Выньте среду из каждой посуды и поместите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте кондиционированную среду для костей при 200-кратной гравитации в течение 10 минут, чтобы удалить любой мусор.

Затем извлеките надосадочную жидкость и пропустите ее через стерильный фильтр 0,2 микрона, храните квадрицепсы Али, замороженные при температуре минус 80 градусов Цельсия, пока они не понадобятся. Начните с посева мезенхимальных клеток человека, таких как костные клетки или фибробласты десны и периодонтальной связки, в 12 китовых пластин в концентрации 30 000 клеток на квадратный сантиметр. Накройте клетки питательной средой и дайте ячейкам прикрепиться к пластине на ночь на следующее утро.

Выбросьте питательную среду и промойте клетки с предварительным подогревом PBS при 37 градусах Цельсия. Затем стимулируйте клетки, добавляя предварительно подогретую сыворотку свободной питательной среды с 20% кондиционированной костью средой и без нее. Если вы также проверяете абсорбционную способность биоматериала, добавьте кондиционированную среду для костей, включая любые контрольные элементы, в пробирки, содержащие интересующий биоматериал, и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем энергично промойте биоматериал предварительно подогретым PBS и высадите на материал мезенхимальные клетки человека в концентрации 30 000 клеток на квадратный сантиметр. Инкубируйте клетки отдельно или посеянные на биоматериалы во увлажненной атмосфере при 37 градусах КС в течение 24 часов. Затем выбросьте питательную среду.

Промойте клетки с помощью предварительно подогретого PBS и извлеките РНК клеток, используя стандартный протокол выделения РНК. После того, как РНК выделена, подготовьте образцы CD NA для каждой группы лечения, начав с равных концентраций выделенной РНК и запустив реакцию обратной транскриптазы на каждом образце. Затем выполните количественную ПЦР в реальном времени на образцах для поиска уровней выбранных генов с использованием праймеров и условий, перечисленных в сопроводительном текстовом протоколе.

Наконец, рассчитайте качество кондиционированной костной среды на основе относительных уровней экспрессии генов путем нормализации до пороговых уровней цикла генов к гену Gabb dh с использованием метода дельта-дельта КТ. Вот некоторые типичные результаты, показывающие изменения в экспрессии генов фибробластов полости рта при воздействии кондиционированной костной среды в течение 24 часов. Два гена адреналина и pent trax и три были значительно снижены до 40% от исходного уровня, в то время как интерлейкины 11 и 33, а также N-A-D-P-H оксидаза 4 и протегликан 4 были повышены в 200 раз.

Интересно, что коллагеновые барьерные мембраны, используемые для защиты костной стружки от окружающих мягких тканей, поглощают большую часть кондиционированной костной среды, которая отвечает за изменения в экспрессии генов. Коллагеновые мембраны, однако, не смогли абсорбировать факторы, которые контролируют экспрессию интерлейкина 33. Таким образом, экспрессия интерлейкина 33 в этих условиях не регулируется.

Описанный здесь протокол может быть адаптирован для изучения реакции различных типов клеток, участвующих в регенерации кости. Кроме того, протокол может быть использован для получения кондиционной среды из технологической кости и других костных наполнителей. Клиническая значимость данного биоанализа остается неясной.

Клеточный ответ на BCM in vivo, вероятно, более сложный и включает в себя большой спектр генов и различных клеток-мишеней, расширяя представленные здесь. Тем не менее, наш биоанализ дает первое представление о предположительно сложном составе молекул костного RAF и клеточном ответе in vitro.