Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Общей целью данного эксперимента является измерение секреции белка отдельными клетками с высоким временным и пространственным разрешением. Это достигается за счет литографического изготовления золотых плазмонных наносенсоров на стеклянных покровных стеклах для визуализации секрета отдельных клеток без меток. В качестве второго шага сенсорный чип очищают и покрывают самоорганизующимся монослоем, а затем функционализируют лигандами, которые имеют высокое сродство к секретируемым белкам аналита.

Затем клетки интегрируются в функционализированные сенсорные чипы для измерения их секреции в пространстве и времени. Результаты показывают, что белковые выделения из отдельных клеток могут быть отображены как пространственно, так и временно без необходимости маркировки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области межклеточной коммуникации, например, как паракринные и аутокринные сигнальные пути управляют подвижностью клеток.

Чтобы начать эту процедуру, нанесите тонкую хромовую пленку толщиной 10 нанометров на ранее очищенные покровные листы путем электронно-лучевого испарения, чтобы избежать эффектов заряда во время моделирования и визуализации наноструктур. После этого вращения первый слой двухслойного резиста, состоящий из этиллактата, сополимера метилметакрилата при 2000 об/мин в течение 45 секунд. Затем запекайте основание при температуре 150 градусов Цельсия, дав основанию остыть до комнатной температуры.

Вращайте второй слой полиметилметакрилата со скоростью 3000 об/мин в течение 45 секунд и запекайте подложку при температуре 150 градусов Цельсия. Двухслойный резист используют с помощью электронно-лучевой литографии или EBL. Разработайте изопропиловый спирт или метилизобутилкетон IPA, или MIBK в соотношении два к одному, и промойте в IPA.

Удалите хром с развитой области наноструктур с помощью мокрого травления с помощью CR 7 травления в течение 10 секунд при комнатной температуре, а затем промойте в деионизированной, дистиллированной дистиллированной воде Нанесите титановую золотую пленку на подложку с помощью электронно-лучевого испарителя после осаждения золота. Снимите бислой сополимера. Противостоять можно, замочив субстрат в ацетоне на четыре часа.

Затем осмотрите подложку с помощью сканирующего электронного микроскопа, чтобы подтвердить форму и размер наноструктуры. Полученные наноструктуры обычно разделены шагом 300 нанометров. Массивы наноструктур размером 20 на 20 расположены на расстоянии 30 микрон от центра к центру.

Оставляя достаточно места для визуализации клеток, типичный чип будет содержать 300 массивов. Удалите остатки хрома с подложки через влажную кромку с помощью CR семь травлений в течение 60 секунд при комнатной температуре. Затем промойте субстрат в деионизированной дистиллированной воде.

Затем исследуйте подмножество массивов с помощью атомно-силового микроскопа для проверки размера и однородности. Этот узорчатый стеклянный защитный накладку можно использовать несколько раз при условии соблюдения надлежащих процедур очистки для очистки и регенерации локализованной поверхности, плазменных и резонансных или LSPR чипов. Плазменная зола мощностью 40 Вт в 300 милли смешивается с 5% водорода и 95% аргоном в течение 45 секунд.

Функционализируйте поверхность золота и наноструктуры сразу после плазменного озоления. Путем погружения чипа в двухкомпонентный раствор этанола тиола, состоящий из соотношения SPO и SPC в соотношении три к одному. Оставив чип в тиоловом растворе на ночь, чтобы сформировать самоорганизующийся монослой, промойте его этанолом и высушите газообразным азотом, загрузите чип LSPR в специально изготовленный микрофлюидный держатель, поместив чип на алюминиевую нижнюю часть.

Затем вставьте чип между этой нижней частью и силиконовой прокладкой и прозрачной пластиковой верхней частью, используя четыре винта для зажима сборки. Для типичного применения тиола на основе SPC нанесите 300 микролитров смеси 133 миллимолярных EDC и 33 миллимолярных NHS в деионизированной дистиллированной воде для активации карбоксильных групп тиолового компонента SPC. Подождав 10 минут, вручную промыть поверхность 10 миллимолярами PBS с последующей конъюгацией активированной карбоксильной группы с интересующим лигандом путем капли покрытия 300 микролитров раствора лиганда.

Подождав один час и промыв поверхность 10 миллимолярным дроп-кодом PBS, 300 микролитров 0,1 молярного этаноламина, введите PBS на чип для минимизации неспецифического связывания. Подождав 10 минут, промойте этаноламин PBS, содержащим 0,005% от 20 до PBST 20. Затем поместите кусочек кварца над чипом, чтобы уменьшить колебания данных, связанных с изменением мениска.

Держите микросхему влажной с помощью буфера PBST 20 во время установки на микроскоп. Присоедините микрофлюидную трубку к сборке и буферу потока до тех пор, пока не будет достигнуто устойчивое состояние. Затем плотно поместите сборку микросхемы LSPR в держатель образца нагреваемого столика.

Оптическая установка для этого метода показана здесь. Свет от галогенной лампы пропускается через фильтр длиной 593 нанометра для устранения длин волн, которые не влияют на наноплазмонный отклик. Затем свет линейно поляризуется, и образец освещается с помощью объектива с числовой апертурой 40 x 1,4 для возбуждения плазмонных наноструктур золота.

Рассеянный свет собирается объективом и пропускается через перекрестный поляризатор для уменьшения фонового сигнала от стеклянной подложки. Светоделитель 50 на 50 вставляется в собранный световой тракт для одновременного спектроскопического анализа и анализа изображений. После того, как сборка и микроскоп находятся в равновесии в течение не менее двух часов, выровняйте микросхему с помощью джойстика так, чтобы центральная матрица была совмещена с оптоволоконным кабелем для спектроскопии.

После культивирования и гранулирования гибридных клеток DOMA методом центрифугирования соберите их, а затем проверьте на жизнеспособность перед введением в чипы LSPR. После этого вручную введите 50 микролитров клеточного раствора в чипы LSPR с помощью микропипетки. Наконец, промойте оставшиеся клетки в растворе свежей средой, не содержащей сыворотки, используя микрофлюидную систему изобилия, чтобы подготовить чипы LSPR к визуализации.

Здесь показано наложение изображения LSPR, на котором выделены квадратные массивы, и изображения с подсветкой проходящим светом, на котором выделена ячейка в левом нижнем углу. Клетка, окрашенная флуоресцентным мембранным красителем Domine, DHPE демонстрирует филоподии, похожие на расширения. Если бы такие расширения перекрывались с массивами, они дали бы ложноположительный результат для данных спектрометрии секреции белка до и после введения насыщающего раствора антител antis cmic в функционализированные матрицы cmic, показанные здесь.

Этот метод используется для того, чтобы откалибровать массивы. Калибровка матриц помогает нормализовать отклик датчиков и определить фракционную занятость на основе профиля биофункционализации каждого прогона. Коммерческий прибор SPR используется для определения константы диссоциации, а также для изучения сопротивления неспецифическому связыванию с использованием того же протокола, который описан для чипа LSPR.

Здесь показаны нормализованные значения из двух массивов. Одна матрица находилась в пределах 10 микрометров от клетки, в то время как контрольная группа находилась в 130 микрометрах от клетки. Внезапное увеличение нормализованного ответа ближайшей к клетке матрицы по сравнению с плоской реакцией контрольной матрицы свидетельствует о локализованном всплеске секретируемых антител.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять секрецию белка из отдельных клеток с высоким пространственным и временным разрешением.