Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Этот протокол описывает, как использовать флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения для визуализации и отслеживания отдельных рецепторов на поверхности живых клеток и тем самым анализировать латеральную подвижность рецептора, размер рецепторных комплексов, а также визуализировать переходные взаимодействия рецептор-рецептор. Этот протокол может быть распространен на другие мембранные белки.

Общая цель данного эксперимента — визуализировать отдельные рецепторы на поверхности живых клеток и проанализировать их расположение, движение и динамическую ассоциацию в супрамолекулярные комплексы. Это достигается за счет экспрессии рецепторов, помеченных щелчками, на очень низких уровнях на поверхности живых клеток и маркировки их яркими органическими флуорофорами, чтобы обеспечить обнаружение одной молекулы. В качестве второго шага клетки визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением, которая позволяет получить быструю последовательность изображений отдельных частиц рецептора, движущихся по поверхности клетки.

Затем к последовательности изображений применяются алгоритмы автоматического обнаружения и слежения, чтобы получить положение и интенсивность каждой рецепторной частицы с течением времени. Получены результаты, которые показывают точный анализ размера рецепторных комплексов в этом примере бета-двух адренорецепторов на основе смешанной гауссовской аппроксимации распределения интенсивности частиц в начале последовательности изображений. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, например, как наши рецепторы организуются в доменах поверхности живых клеток.

Как они взаимодействуют друг с другом, образуя димеры и олигомеры, и как на самом деле происходят динамические события, лежащие в основе рецепторной сигнализации. Основное преимущество этой методики перед стандартными биохимическими методами и методами микроскопии заключается в том, что она исследует поведение отдельных рецепторов в природной среде, что позволяет нам изучать важные аспекты, которые обычно скрыты при измерениях ансамбля. Покровные стекла для образцов должны быть тщательно очищены, чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию Во время визуализации используйте чистый пинцет для размещения 24 миллиметров в диаметре.

Стеклянная крышка вставляется в держатель защитного стекла, который отделяет отдельные защитные крышки. Поместите держатель с покровными стеклами в стакан и добавляйте хлороформ, пока покровные стекла не будут закрыты. Накройте стакан алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить испарение, и окунитесь ультразвуком в ванну.

Обрабатывайте ультразвуком в течение одного часа при комнатной температуре. Через час извлеките держатель чехла из стакана и дайте чехлу высохнуть. Далее поместите держатель с крышкой в другой стакан и добавьте пять моляров раствора гидроксида натрия до тех пор, пока крышка не будет покрыта.

Как и раньше, накройте стакан фольгой и обработайте ультразвуком в течение одного часа при комнатной температуре, переложите чехол чехла в новый стакан и трижды промойте дистиллированной водой. Наконец, положите очищенные покровные листы в стеклянную чашку для клеточных культур, наполненную 100% этанолом. Здесь показаны покровные стекла до и после очистки, полученные с помощью флуоресценции полного внутреннего отражения или микроскопии газона.

Калибровочные образцы Cal используются для оценки интенсивности отдельных флуоресцентных молекул во время микроскопии газона. Чтобы подготовить образцы, растворите флуоресцентный краситель в соответствующем растворителе. Приготовьте от одного до 10 серийного разведения флуоресцентного красителя в диапазоне от одного пикамоляра до одного аномоляра.

В фильтре стерилизована вода. Вымойте предварительно очищенные покровные листы, переложив их в чашку для клеточных культур, наполненную фильтрованной стерилизованной водой. После этого поместите каждую крышку в лунку шестилуночного клеточного планшета и подождите, пока они не высохнут на 20 микролитров каждого разбавителя флуоресцентного красителя на отдельном очищенном покровном листе.

Дайте чехлу высохнуть под стерильным колпаком. Перед трансфекцией защищайте чехол от света и пыли до использования. Подготовьте планшет для клеточных культур с шестью лунками: промойте очищенные защитные стекла стерильным PBS и поместите по одному покровному листу в каждую лунку из шести луночных планшетов для клеточных культур.

Клетки СНО, которые должны быть трансфицированы для этого исследования, культивируют при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 в одной, один к одному, модифицированной смесью питательных веществ F 12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином и стрептомицином после трипсина, и подсчитывают клетки по стандартным методам с плотностью от трех до 10 до пятых клеток в лунке. В шестой лунке планшет для культивирования клеток, содержащий покровные стекла, дайте клеткам расти в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы достичь примерно 80% текучести CO, что является оптимальной плотностью клеток. Для переработки.

Наиболее сложным аспектом этого протокола является достижение чрезвычайно низкого уровня экспрессии мембранных рецепторов на поверхности клетки для обеспечения успеха. Состояние трансфекции. Например, количество плюс медиа NA и время после трансфекции должны быть оптимизированы в день трансфекции.

Приготовьте реагенты для трансфекции, для каждого разведите два микрограмма нужной плед ДНК в 500 микролитрах оптимальной среды в другой пробирке. Для каждой лунки разводят шесть микролитров Lipectomy 2000 в 500 микролитрах среды Optum. Инкубируйте обе трубки при комнатной температуре в течение пяти минут.

Через пять минут соедините оба раствора в одну пробирку и перемешайте до получения трансфекционной смеси. Инкубируйте трансфекционную смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. Тем временем подготовьте клетки СНО.

Промойте клетки дважды с помощью предварительно предупрежденного PBS После второго промывания замените PBS на один миллилитр на лунку фенолового красного свободного средства D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FBS, но без антибиотиков. Добавьте по одному миллилитру смеси для трансфекции по каплям в каждую лунку и осторожно покачивайте пластину вперед и назад, чтобы обеспечить полное перемешивание. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 в течение двух-четырех часов, прежде чем немедленно приступить к мечению белка.

Чтобы начать эту процедуру, разведите один микролитр фторуглеродного конъюгированного производного бензогина или стокового раствора фторчетырех BG в одном миллилитре среды D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FBS для получения конечной концентрации одного микромоляра. Достаньте трансфицированные клетки из инкубатора и дважды промойте с помощью предварительно подогретого PBS. Замените PBS одним миллилитром одного микромолярного раствора фторуглерода с четырьмя BG и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 в течение 20 минут.

Затем трижды промойте клетки средой D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FBS каждый раз, после чего проведите пятиминутную инкубацию при 37 градусах Цельсия. С помощью пинцета перенос покровных листов с мечеными ячейками в камеру для визуализации. Дважды промойте 300 микролитрами буфера для визуализации.

Добавьте 300 микролитров свежего буфера для визуализации и сразу приступайте к получению изображений. Использование газонного микроскопа, оснащенного масляным иммерсионным объективом, объективом с высокой числовой апертурой, подходящими лазерами, устройством для умножения электронов с зарядовой связью, камерой и инкубатором, а также контролем температуры. Задайте нужные параметры микроскопа, то есть угол лазерной линии, угол экспозиции, время, скорость кадра, а также количество снимков на фильм.

Нанесите каплю иммерсионного масла на объектив микроскопа со 100-кратным увеличением. Поместите камеру визуализации с мечеными клетками на держатель образца микроскопа и сфокусируйте клетки. Использование светлопольной подсветки.

Переключитесь на освещение газона. Держите мощность лазера как можно ниже, чтобы можно было найти нужную клетку, но в то же время свести к минимуму фотообесцвечивание. Выберите нужную ячейку и тоньте.

Отрегулируйте фокусировку. Увеличьте мощность лазера до уровня, позволяющего визуализировать одиночные флоры четверки. Получите последовательность изображений и сохраните последовательность изображений в формате RAW в формате TIFF для калибровки.

Соберите каждый калибровочный образец в камере визуализации и поместите его на микроскоп. Выберите образец, содержащий хорошо отделенную дифракцию. Ограниченные пятна, которые отбеливаются за один этап.

Последовательности изображений газона впоследствии получают таким же образом, как показано для меченых клеток. Чтобы подготовить последовательность изображений, используйте программное обеспечение для обработки изображений, такое как Image J, для обрезки изображений. Сохраняйте отдельные кадры как отдельные изображения в формате TIFF в новой папке, указывая номер кадра на каждом изображении.

Обнаружение и отслеживание частиц выполняется с помощью некоммерческого программного обеспечения, такого как U Track, в среде MATLAB. В командной строке MATLAB введите селектор фильмов, графический интерфейс. Чтобы открыть интерфейс выбора фильмов, следуйте инструкциям по созданию новой базы данных фильмов, начиная с ранее сохраненных отдельных изображений.

Укажите размер пикселя в нанометрах, временной интервал в секундах, числовую апертуру, глубину цвета камеры и длину волны излучения флуорофора, необходимые для обнаружения и отслеживания частиц. Сохраните базу данных фильмов из интерфейса выбора фильмов. Запустите анализ, выбрав отдельные частицы в качестве типа объекта.

Запустите алгоритм обнаружения, затем запустите алгоритм отслеживания. Используйте подпрограмму просмотра фильмов, содержащуюся в пакете URAC, для визуализации дорожек и проверки качества обнаружения и отслеживания. Откройте файл dot MAT, чтобы увидеть положение и амплитуду отслеживаемых частиц на каждом кадре.

Размер частиц также может быть рассчитан на основе полученных данных. Здесь показан первый кадр типичной последовательности изображений клетки, трансфицированной мечеными бета-двумя адренорецепторами и помеченной производным бензилгина фторуглеродом. Пятна представляют собой одиночные рецепторы или рецепторные комплексы.

Алгоритм обнаружения применяется к одной и той же последовательности изображений, и каждая обнаруженная частица обозначается синим кругом, применяемым алгоритмом отслеживания. К такому же образу последовательности приводят траектории отдельных частиц, обозначенные синим цветом. Зеленые сегменты представляют события слияния, а красные сегменты — события разделения.

Этот метод также захватывает динамические события. В этом примере две частицы претерпевают переходное взаимодействие, движутся вместе в течение нескольких кадров и снова разделяются. Траектории отдельных частиц используются для расчета коэффициентов их диффузии.

Этот репрезентативный результат показывает, что бета-2 адренергический рецептор обладает высокой подвижностью. В то время как рецептор ГАМК B имеет ограниченную подвижность, размер рецепторных комплексов можно точно оценить, подогнав распределения интенсивностей частиц к смешанной модели Гаусса. Этот анализ также может выявить сосуществование мономеров и димеров.

Здесь показаны примеры обесцвечивания мономерных рецепторных частиц в одну стадию и отбеливания диаметральных рецепторных частиц в две стадии. Эти процедуры могут быть расширены и адаптированы для работы с другими белками клеточной поверхности, методами выравнивания и клеточными моделями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обеспечить чистый покровный сон, как получить низкий уровень экспрессии и эффективную маркировку яркими органическими флюоросами, а также как получать и анализировать изображения газона, которые представляют все ключевые шаги для успешной одиночной молекулы.