Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в исследовании биоэффектов, индуцированных кавитацией в условиях микрофлюидного ограничения, с использованием структурирования поверхности для точного контроля генерации тандемных пузырьков, а также расположения и формы отдельных целевых клеток. Эта микрофлюидная система позволяет проводить эксперименты с транзитными кавитационными пузырьками и клетками, что имеет значение для терапевтического применения и разработки методов ультразвукового воздействия. Основное преимущество данного метода заключается в повышении точности за счет структурирования поверхности.

Это позволяет изучать биоэффекты отдельных клеток и обеспечивает высокую скорость загрузки за счет надежного взаимодействия пузырька с пузырьком. Визуальная демонстрация процедур имеет решающее значение, поскольку этапы создания структур на поверхности и подготовки клеток в чипе сложны и включают различные методы и рекомендации. Выполняйте все процедуры микрофабрикации в чистой комнате, используя соответствующий защитный костюм.

Рассчитайте площадь каждой золотой точки в пределах от 25 до 30 квадратных микрон, чтобы она была достаточно большой для поглощения энергии лазера, необходимой для генерации пузырьков, но достаточно малой, чтобы предотвратить адгезию отдельных клеток. Очистите предметное стекло в химическом вытяжном шкафу согласно текстовому протоколу, затем перейдите к шкафу для центрифугирования (spin coating hood). Запрограммируйте центрифугу для нанесения покрытий на ускорение до 1000 RPM за две секунды с поддержанием этой скорости в течение пяти секунд, затем на разгон до 3000 RPM за три секунды с поддержанием этой скорости в течение 30 секунд.

Затем закрепите предметное стекло на центрифужном напылителе с помощью вакуумного прижима. После этого нанесите на стекло P20 и запустите цикл центрифугирования. Затем нанесите негативный фоторезист NFR, используя тот же цикл.

Теперь запекайте предметное стекло на нагревательном плитке при 95 °C в течение 60 секунд. После охлаждения до комнатной температуры проведите фотолитографию. Установите хромическую маску в установку для совмещения масок, убедившись, что сторона с рисунком обращена вниз к предметному стеклу.

Затем установите режим фотолитографии на жесткое экспонирование с временем УФ-облучения девять секунд и совместите стеклянную подложку с маской. После УФ-облучения подвергните предметное стекло запеканию при 95 °C в течение одной минуты, а затем дайте ему остыть, как и прежде. Чтобы проявить рисунок на стекле, поместите его в раствор проявителя на 60 секунд, затем промойте стекло дистиллированной водой и высушите потоком азота.

После подтверждения рисунка путем микроскопического исследования подвергните предметное стекло обжигу при 120 °C в течение пяти минут, затем дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем очистите стекло плазмой в установке реактивного ионного травления в течение 90 секунд при давлении 500 tor и мощности 100 watts. С помощью электронно-лучевого испарителя закрепите образец на держателе пластин с помощью клейкой ленты.

Запрограммируйте установку на осаждение слоя титана толщиной 5 nanometer, за которым следует слой золота толщиной 15 nanometer. После завершения этого этапа вентилируйте камеру установки. Затем выдержите предметное стекло в течение ночи в стакане с растворителем для удаления фоторезиста, чтобы удалить золото, находящееся поверх резиста NFR.

На следующий день промойте предметное стекло ацетоном, затем IPA, после чего высушите его потоком азота. Промойте стекло деионизированной водой и снова высушите азотом. Теперь нагрейте предметное стекло при 115 °C в течение пяти минут.

Затем очистите предметное стекло с паттерном из золотых точек с помощью установки для кислородно-плазменного пепельного осаждения при мощности 100 ватт в течение 90 секунд. Установите площадь каждого островка, кодированного фибронектином, в пределах от 700 до 900 квадратных микрон, чтобы обеспечить адекватное распластывание клеток hela в квадратной области, минимизируя при этом вероятность агрегации нескольких клеток на одном островке. Процесс изготовления в значительной степени аналогичен созданию золотого паттерна.

Нанесите на предметное стекло слой положительного фоторезиста S18 методом центрифугирования, как и ранее, и запеките его при 115 °C. Затем проведите фотолитографию, совместив метки на маске с метками на подложке. Проверьте рисунок на центральном участке, чтобы подтвердить правильный угол, и отрегулируйте расстояние от золотых точек до H-образного паттерна.

Проведите УФ-экспонирование в течение девяти секунд без последующего запекания. Следующее отличие заключается в том, что этап проявления занимает всего 45 секунд. Для реактивного ионного травления установите следующие параметры: 500 tor, 100 watts и 90 секунд.

Затем нанесите каплю пассивирующего раствора PLLG peg на фрагмент парафиновой пленки и прижмите пленку с раствором к стороне предметного стекла с нанесенным паттерном. Избегайте образования пузырьков воздуха. Через 45 минут снимите предметное стекло с пленки.

Промойте предметное стекло деионизированной водой, затем высушите его потоком азота. Далее последовательно погрузите предметное стекло в средство для удаления фоторезиста 1165, а затем в 50%-ный раствор 1165 в деионизированной воде.

Затем промойте только деионизированной водой. При каждой промывке перемешивайте раствор в ультразвуковой бане в течение 90 секунд. Затем высушите предметное стекло на нагревательной плитке, после чего герметично поместите его в эксикатор и храните при температуре 4 °C.

Соберите микрофлюидный чип из предметных стекол согласно текстовому протоколу. Убедитесь, что структурированная область стеклянной подложки тщательно защищена небольшим блоком PDMS перед использованием реактивного ионного травления для удаления PLLG-пега с периферийной области. Извлеките структурированное стекло из установки RIE и снимите блок PDMS.

После обработки микроканала из PDMS пониженной дозой кислородной плазмы совместите его с текстурированной стеклянной подложкой под стереомикроскопом. Плотно прижмите микроканал из PDMS к текстурированной стеклянной подложке. Теперь чип готов к использованию.

Сначала подготовьте чип, пропуская PBS через микроканал в течение 30 минут со скоростью 1 µL/min. Затем заполните чип раствором фибронектина в течение 45 минут с той же скоростью потока. Пока идет этот процесс, приготовьте клеточную суспензию с концентрацией 5 × 10⁶ клеток/мл.

Для данной процедуры критически важны хорошее состояние и высокая степень конфлюэнтности клеток. Затем замените раствор, протекающий через чип, на PBS и увеличьте скорость потока до 10 µL/min. Промывайте систему раствором PBS в течение пяти минут.

Затем с помощью шприца введите подготовленные клетки в чип. Когда из трубки вытечет одна капля, остановите инъекцию и пережмите выходное отверстие. После этого поместите чип в инкубатор на 30 минут.

Затем откройте выходной клапан и промойте чип культуральной средой со скоростью 10 µL/мин в течение пяти минут. По истечении пяти минут снизьте скорость потока до 0.75 µL/мин и поместите чип и насос в инкубатор на два часа. Через два часа приступите к тандемной генерации пузырьков, наблюдая за чипом под инвертированным микроскопом с двумя импульсными лазерами NDI, подключенными к контроллерам времени и направленными на паттерн из золотых точек, при этом высокоскоростная камера должна быть готова к фиксации результатов.

Для пузырьков размером 50 микрон установите задержку между двумя лазерами 2,5 микросекунды, а их мощность — 10 микроджоулей. Затем синхронизируйте запись высокоскоростной камеры с лазерами и выполняйте запись с частотой 2 миллиона кадров в секунду при экспозиции 200 наносекунд. Таким образом регистрируется динамика расширения пузырьков, их коллапс, взаимодействие между пузырьками и формирование струй.

С помощью описанного метода на уровне отдельных клеток были изучены взаимодействия пузырька с пузырьком и различные биоэффекты, вызванные кавитацией, такие как кратковременные взаимодействия тандемных пузырьков с формированием струи, визуализация результирующего поля потока и расчет скорости струи. Направленный струйный поток вокруг тандемного пузырька имеет скорость около ten meters per second и ширину около ten microns, и, таким образом, способен создавать импульсное и локализованное напряжение сдвига и градиент напряжения на близлежащих клетках-мишенях. Также была изучена деформация клеточной мембраны, вызванная тандемным пузырьком.

Деформация и восстановление мембраны регистрируются по смещению функционализированных микросфер, прикрепленных к переднему краю клеточной мембраны. Локальная деформация площади рассчитывалась по координатам триады соседних микросфер. На данной схеме показано максимальное изменение площади в различных точках поверхности клетки.

Передний край преимущественно растягивается, в то время как задний край или боковые стороны клетки сжимаются, что указывает на гетерогенность и деформацию клетки, вызванную струйным потоком при взаимодействии тандемных пузырьков. Временная вариация деформации площади на переднем крае клетки состоит из нескольких быстрых осцилляций, за которыми следует значительное и длительное растяжение в течение примерно 100 microseconds, и последующее постепенное восстановление на временном интервале в несколько milliseconds. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как организовать контролируемое взаимодействие пузырьков для изучения биоэффектов в одиночных клетках с заданной формой и расположением, определенным с помощью структурирования поверхности.

После выполнения данной процедуры можно провести дополнительные исследования, такие как анализ истончения цитоскелета и конъюгационная визуализация, чтобы изучить перестройку цитоскелета клеток при воздействии тандемных пузырьков. После окончательной разработки этот метод позволит исследователям в области субтерапевтического ультразвука изучать биоэффекты, индуцированные захватом, на уровне отдельных клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать оптимальную плотность и состояние клеточного монослоя для успешного паттернирования клеток.

Не забывайте, что работа с химикатами в чистом помещении и с лазерами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и защитных лазерных очков.