Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в исследовании биоэффектов, индуцированных кавитацией в микрофлюидном удержании, с использованием поверхностного моделирования для точного управления генерацией тандемных пузырьков, а также расположением и формой отдельных клеток-мишеней. Эта микрофлюидная система позволяет экспериментировать с этими транзитными кавитационными пузырьками и клетками, что имеет отношение к терапевтической и звуковой публикации и звуковой работе. Основное преимущество этой техники заключается в повышении точности при нанесении поверхностных узоров.

Он позволяет изучать биоэффекты отдельных клеток и представляет собой высокую нагрузку потока от надежного взаимодействия пузырь-пузырь. Визуальная демонстрация процедур имеет решающее значение, поскольку структурирование поверхности и подготовка клеток на этапах чипа являются сложными и включают в себя различные методы и наконечники. Выполняйте все процедуры микропроизводства в чистой комнате, надев костюм для чистой комнаты.

Спроектируйте площадь каждой золотой точки в пределах от 25 до 30 квадратных микрон, чтобы она была достаточно большой, чтобы поглощать энергию лазера для генерации пузырей, но достаточно маленькой, чтобы избежать прилипания к ней отдельных клеток. Очистите предметное стекло в химической вытяжке в соответствии с текстовым протоколом, после чего приступайте к отжимному покрытию вытяжки. Запрограммируйте спин-кодер на ускорение до 1000 об/мин в течение двух секунд и поддержание этой скорости в течение пяти секунд, затем разгоните его до 3000 об/мин в течение трех секунд и поддерживайте эту скорость в течение 30 секунд.

Далее закрепите предметное стекло на спин-кодировщике с помощью пылесоса. Затем накройте слайд P20 и запустите цикл отжима. Далее нанесите негативный фоторезист NFR по тому же циклу.

Теперь запекайте горку на горячей плите при температуре 95 градусов Цельсия в течение 60 секунд. После охлаждения до комнатной температуры выполните фотолитографию. Установите хромированную маску на выравниватель маски и убедитесь, что сторона узора обращена вниз к предметному стеклу.

Затем установите рецепт фотолитографии в режим жесткой экспозиции с девятью секундами ультрафиолетового излучения и совместите стеклянную подложку с маской. После воздействия ультрафиолета запекайте предметное стекло при температуре 95 градусов Цельсия в течение одной минуты, а затем дайте ему остыть, как и раньше. Чтобы отобразить рисунок на предметном стекле, поместите его в раствор проявителя на 60 секунд, затем промойте предметное стекло дистиллированной водой и высушите его газообразным азотом.

После подтверждения рисунка микроскопическим осмотром запекайте предметное стекло при температуре 120 градусов Цельсия в течение пяти минут и дайте ему остыть до комнатной температуры. Теперь очистите предметное стекло плазмой в реактивной машине ионного травления в течение 90 секунд при мощности 500 тор и 100 Вт. С помощью электронно-лучевого испарителя прикрепите образец к держателю пластины.

Запрограммируйте машину на нанесение 5-нанометрового слоя титана, а затем 15-нанометрового слоя золота. Как только это положение будет завершено, проветрите машину. Затем замочите предметное стекло на ночь в стакане с растворителем для удаления фоторезиста, чтобы удалить золото, лежащее поверх резиста NFR.

На следующий день промойте горку ацетоном, затем IPA, а затем высушите азотом. Промойте предметное стекло деионизированной водой и снова высушите азотом. Теперь нагрейте предметное стекло до 115 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем очистите предметное стекло с золотым точечным рисунком с помощью кислородно-плазменного ашера мощностью 100 Вт в течение 90 секунд. Установите площадь каждого островка, кодируемого фибронектином, в пределах от 700 до 900 квадратных микрон, чтобы способствовать адекватному распространению клеток hela в квадратной области и свести к минимуму вероятность скопления нескольких клеток на островке. Изготовление очень похоже на изготовление золотого узора.

Открутите слайд, как и раньше, с помощью положительного фоторезиста S18 и запекайте на кодировке при температуре 115 градусов по Цельсию. Затем проведите фотолитографию, совместив метки на маске с метками на подложке. Проверьте узор на центральной части, чтобы убедиться в правильности угла, и отрегулируйте расстояние от золотых точек до узора H.

Проведите воздействие ультрафиолета в течение девяти секунд без последующего выпекания. Следующее отличие заключается в том, что этап разработки занимает всего 45 секунд. Для реактивного ионного травления установите париметры на 500 тор 100 Вт и 90 секунд.

Затем нанесите каплю пассивирующего раствора PLLG на кусок парафиновой пленки и нанесите раствор на сторону узора предметного стекла. Избегайте попадания пузырей. Через 45 минут снимите предметное стекло с пленки.

Промойте предметное стекло деионизированной водой, а затем высушите азотом. Далее последовательно замочите предметное стекло в средстве для удаления фоторезиста 1165. Затем 50 процентов 1165 в деионизированной воде.

Затем просто вода DI. Во время каждой ванны перемешивайте раствор в ультразвуковой ванне в течение 90 секунд. Теперь высушите предметное стекло на горячей плите, затем запечатайте его в эксикаторе и храните при температуре 4 градуса Цельсия.

Соберите слайды в микроканальную микросхему, как описано в текстовом протоколе. Обратите особое внимание на экранирование узорчатой области стеклянной подложки небольшой пластиной PDMS, прежде чем использовать реактивное ионное травление для удаления штифта PLLG из периферийной области. Извлеките узорчатое стекло из машины RIE и снимите маленькую плиту PDMS.

После обработки микроканала PDMS уменьшенной дозой кислородной плазмы выровняйте его по структурированной стеклянной подложке под стереоскопом. Приведите микроканал PDMS и подложку из узорчатого стекла в конформный контакт. Теперь приступайте к использованию чипа.

Во-первых, заправьте чип, подавая PBS по микроканалу в течение 30 минут со скоростью один микролитр в минуту. Затем настаивайте на чипе раствор фибронектина в течение 45 минут с той же скоростью потока. Пока ждете, подготовьте клетки из расчета пять миллионов клеток на миллилитр.

Здоровое состояние и высокая конфлюенция имеют решающее значение для этой процедуры. Позже замените протекающий через чип раствор на PBS и увеличьте расход до десяти микролитров в минуту. Дайте PBS течь в течение пяти минут.

Далее с помощью шприца в чип вводят подготовленные клетки. Когда из трубки вытекла одна капля, прекратите впрыск и зажмите выпускное отверстие. Затем поместите чип в инкубатор на 30 минут.

Позже освободите выходное отверстие и промойте чип средой для клеточных культур со скоростью десять микролитров в минуту в течение пяти минут. Через пять минут снизьте расход до 0,75 микролитра в минуту и перенесите чип и насос в инкубатор на два часа. Через два часа продолжайте тандемную генерацию пузырей, рассматривая чип под перевернутым микроскопом с двумя импульсными NDI-лазерами на временных регуляторах, направленных на рисунок золотых точек, и с высокоскоростной камерой, готовой к захвату результатов.

Для пузырей размером 50 микрон установите задержку между двумя лазерами равной 2,5 микросекунды и установите их мощность равной десяти микроджоулям. Затем синхронизируйте высокоскоростную запись с камеры с лазерами и делайте записи со скоростью два миллиона кадров в секунду с выдержкой 200 наносекунд. Таким образом, зафиксирована динамика расширения пузыря, взаимодействия коллапса пузырь-пузырь и струйного образования.

С помощью описанной методики изучались взаимодействия пузырьков-пузырей и различные биологические эффекты, индуцированные кавитацией, на уровне отдельных клеток, такие как переходные взаимодействия тандемных пузырьков с образованием струи, визуализация результирующего поля потока и расчет скорости струи. Направленный струйный поток вокруг тандемного пузыря составляет около десяти метров в секунду, имеет ширину около десяти микрон и, таким образом, способен создавать импульсное и локализованное напряжение и градиент напряжения на близлежащих клетках-мишенях. Также изучалась индуцированная тандемными пузырьками деформация клеточной мембраны.

Деформация и восстановление мембраны проявляются в смещении функционализированных шариков, прикрепленных к переднему краю клеточной мембраны. По координатам триады соседних бусин была рассчитана локальная деформация площади. На этой схеме показано максимальное изменение площади в различных местах на поверхности ячейки.

Передний край в первую очередь растянут, в то время как задний край или боковые стороны ячейки сжаты, что указывает на неоднородность и деформацию ячейки, вызванную струйным потоком, вызванным тандемным пузырьком. Временное изменение деформации площади на переднем крае клетки состоит из нескольких быстрых колебаний, за которыми следует большое и устойчивое растяжение в течение примерно 100 микросекунд и последующее постепенное восстановление в масштабе нескольких миллисекунд. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как осуществить управляемое взаимодействие пузырь-пузырь для изучения биоэффектов отдельных клеток с контролируемой формой и расположением по поверхностному рисунку.

После этой процедуры могут быть выполнены другие меры, такие как истончение цитоскелета и визуализация в супружеском браке, для изучения перестройки цитоскелета клетки при лечении тандемным пузырем. После его разработки этот метод проложит путь исследователям в области субпретического ультразвука для изучения биоэффектов, индуцированных каптацией, на уровне отдельных клеток. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании хорошей конфлюенции клеток и условий для успеха во время формирования клеточного паттерна.

Не забывайте, что работа с химическими веществами и лазерами в чистых помещениях может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лазерных очков.