Автоматизированная модульная Высокая пропускная способность экзополисахарида Скрининг платформа В сочетании с высокочувствительными анализа Углеводы отпечатков пальцев

Общей целью этого подхода является быстрый и надежный скрининг микробных продуцентов экзополисахаридов и идентификация их углеводного отпечатка. Это важный шаг для того, чтобы использовать неизученное разнообразие экзополисахаридов. Наш метод может помочь ускорить исследования полимеров в области микробных экзополисахаридов.

Это позволяет быстро идентифицировать новые варианты полисахаридов с различными свойствами для конкретных применений. Основным преимуществом этой методики является комбинация различных систем обнаружения экзополисахаридов в модульной и полностью автоматизированной концепции скрининга. Это делает его чрезвычайно быстрым и надежным.

Этот метод также может быть выполнен вручную в лабораториях, где нет доступной платформы автоматизации, поэтому его использование очень гибкое и может быть адаптировано к различным потребностям скрининга. Эта платформа для скрининга экзополисахаридов, или ЭПС, имеет модульную установку, которая позволяет разделить протокол на две основные части: автоматизированный скрининг и дактилоскопирование углеводов. Первая задача состоит в том, чтобы культивировать штаммы для скрининга и удалить клетки с помощью центрифугирования.

Штаммы культивируются на глюкозе в качестве источника углерода в 96-луночных планшетах, покрытых дышащей герметизирующей пленкой на встряхивателе с микротитрами при температуре 30 градусов Цельсия и 1000 об/мин. В день показа экрана подготовьте рабочий стол робота и карусель для хранения, как описано в тексте протокола. Снимите с пластин дышащую уплотнительную пленку и распределите основные культуры в положениях карусели от 1-1 до 1-4.

Запустите автоматизированную роботизированную программу. Для удаления клеток после культивирования перенесите основную культуру в глубокие лунки планшетов из карусели в центрифугу и центрифугируйте при 4, 300 х г и 20 градусах Цельсия в течение 30 минут. Для осаждения перед фильтрацией переместите микротитровые пластины, а также микротитровые пластины с индикатором pH, с карусели на рабочий стол.

Также перенесите фильтрующие пластины, которые обеспечивают полное удаление всех бактериальных клеток, вместе с коллекторными пластинами на их рабочие места. После центрифугирования перенесите 180 микролитров основного надосадочной жидкости культуры на фильтрационную пластину. Отасуньте 150 микролитров из надосадочной жидкости основной культуры и распределите 50 микролитров в микротитровый планшет для осаждения перед фильтрацией и 100 микролитров в индикаторный планшет pH.

Для оценки продукции ЭПС проводят осаждение надосадочной жидкости с 2-пропанолом. С помощью многоступенчатой пипетки объемом 12,5 миллилитров вручную добавьте 150 микролитров 2-пропанола в каждую лунку. После встряхивания микротитровых пластин при комнатной температуре в течение 10 минут при 900 об/мин визуально наблюдайте за образованием волокон или чешуек, которые указывают на выработку пенополистирола.

После того как основные тарелки культуры будут сохранены обратно в карусель, осмотрите ферментационные бульоны, на которых должно быть показано снижение осадка после центрифугирования. Увеличение вязкости является еще одним признаком производства пенополистирола. Вторая задача заключается в обеспечении полного удаления клеток из вязкого брожения бульона с помощью 96-луночной фильтрации.

Центрифугируйте фильтрующие пластины при температуре 3 000 x g и 20 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем верните пластины в исходное положение карусели и выполните балансировку гелевой фильтрации, как описано в тексте протокола. Далее пипеткой впрыскиваем 35 микролитров фильтрата в центр уравновешенной гелево-фильтрационной пластины, и 50 микролитров в микротитровую пластину, которая используется для осаждения.

Переместите пластины для фильтрации геля в центрифугу, а все остальные пластины переместите с рабочего стола обратно в исходные позиции в карусели. После того, как все пластины будут помещены обратно в карусель, обратите внимание на высоковязкие надосадочные жидкости, о чем свидетельствуют остатки в фильтрующей пластине. Недостаток фильтрата может привести к ложноотрицательным результатам в следующих аналитических модулях.

Третьей задачей автоматизированного скрининга является удаление оставшихся мономерных сахаров из питательных сред с помощью 96-луночной гелевой фильтрации. Центрифугируйте фильтрующие пластины геля при температуре 1 000 x g и 20 градусах Цельсия в течение двух минут. Подготовьте рабочий стол с помощью робота-манипулятора для обработки гелевых фильтратов.

Чтобы обнаружить оставшуюся глюкозу после гелевой фильтрации, нам 50-литровыми наконечниками переложить 25 микролитров дважды дистиллированной воды в пресную микротитровую пластину. Отсадите 20 микролитров дважды дистиллированной воды, пять микролитров воздуха и 5 микролитров гель-фильтрата и распределите в ту же тарелку. Возьмите наконечники объемом 200 микролитров и аспирируйте 50 микролитров смеси реагентов для анализа глюкозы из положения рабочего стола 1-2, чтобы начать первый анализ.

Переместите микротитровые планшеты в инкубатор. После 30 минут инкубации переместите планшеты из инкубатора в считыватель микротитров и зарегистрируйте поглощение на 418 и 480 нанометрах. Для определения общего содержания углеводов фенолсерно-сернокислотным методом пипеткой в микротитровые пластины вводят пипеткой 20 мкл геля-фильтрата.

Вручную снимите пластины с карусели и поместите их в станцию обработки жидкостей. Включите калибровочную пластину с 20 микролитрами глюкозы разной концентрации в трех количествах. Поместите контейнер для отходов в положение 1, контейнер для чаевых объемом 300 микролитров в положение 2 и корыто объемом 250 миллилитров со 110 миллилитрами свежеприготовленной фенол-серной кислоты в положение 3.

С помощью 8-канальной пипетки с наконечниками объемом 300 микролитров передайте 180 микролитров фенол-серной кислоты в каждый ряд всех пластин. Накройте все микротитровальные пластины крышками и перемешайте, встряхивая в течение пяти минут при 900 об/мин при комнатной температуре. Выдерживать 35 минут при температуре 80 градусов Цельсия в духовке для проведения цветовой реакции.

После охлаждения пластин под вытяжным шкафом измерьте затухание на 480 нанометрах. Штаммы, полученные в результате автоматического скрининга, обозначаются как EPS-положительные, если они соответствуют хотя бы двум из следующих трех критериев. Контроль вязкости, определение полимера и расчетного эквивалента глюкозы.

Эквивалент глюкозы рассчитывается с помощью этого уравнения. Отпечаток углеводов платформы для скрининга содержит последние три задачи, которые выполняются вручную. Оставшийся фильтрат положительных попаданий из второго задания обеспечивает основу для гель-фильтрата в пятом задании.

Шестая задача – 96-луночный микрогидролиз гель-фильтрата. Для этого сначала с помощью 12-канальной пипетки объемом 50 микролитров необходимо перенести 20 микролитров гелевого фильтрата на новую ПЦР-планшет. Затем с помощью многоступенчатой пипетки объемом 1,25 мл добавьте в каждую лунку по 20 микролитров четырех моляров трифторуксусной кислоты.

Накройте ПЦР-планшет колпачком из термопластичного эластомера и поместите ПЦР-планшет в специальное зажимное устройство. Перемешайте растворы, перевернув зажимное устройство 10 раз. После центрифугирования ПЦР-планшета и закрепления его в зажимном устройстве, поместите защищенное зажимное устройство в предварительно разогретую песчаную ванну и инкубируйте при температуре 121 градус Цельсия в течение 90 минут.

С помощью 12-канальной пипетки объемом 200 микролитров добавьте 3,2%-ный раствор аммиака, чтобы довести pH примерно до восьми. Накройте ПЦР-планшет колпачком из термопластичного эластомера и встряхните его вручную с помощью зажимного устройства. Конечная задача состоит в том, чтобы проанализировать Carbohydrate Fingerprint с помощью высокопроизводительного метода 1-фенил-3-метил-5-пиразолон, или HTPMP.

Чтобы начать эту процедуру, с помощью 12-канальной пипетки объемом 50 микролитров 25 микролитров нейтрализованного гидролизата можно перенести на свежую ПЦР-планшет. Добавьте 75 микролитров дериватизационной смеси-реагента и накройте пластину колпачком из термоэластопласта и колпачком. Поместите ПЦР-планшет в ПЦР-амплификатор при температуре 70 градусов Цельсия на 100 минут, после чего охладите до 20 градусов Цельсия.

Перенесите 20-микролитровую аликвоту в новую микротитровую пластину, затем с помощью 12-канальной пипетки объемом 200 микролитров добавьте 130 микролитров 19,23 миллимолярной уксусной кислоты в каждую линию. Перемешайте непосредственно с помощью аспирации и дозирования не менее шести раз и перенесите всю жидкость на фильтрующую пластину толщиной 0,2 микрометра с пластиной для сбора микротитров Центрифугируйте пластину при давлении 1 000 x g в течение пяти минут, снимите фильтрующую пластину и закройте пластину коллектора микротитров силиконовым колпачком.

Поместите микротитровую пластину в UHPLC-UV-ESI-MS для определения углеводного отпечатка. В этой таблице представлены результаты трех образцовых новых штаммов, успешно идентифицированных с помощью этой скрининговой платформы. В левой части таблицы представлены результаты работы автоматизированных модулей скрининга по формированию вязкости, получению полимеров и эквиваленту глюкозы от общего гидролиза, которые были использованы в качестве оценочных параметров для детального анализа Carbohydrate Fingerprint.

Углеводный отпечаток на основе калиброванных сахаров, а также неизвестных сахаров, димеров и заместителей приведен в правой части таблицы. Используя эту информацию, можно рассчитать мономерный состав и сравнить его с уже известными полимерными структурами. Кроме того, может быть проведен целенаправленный скрининг на интересные мономерные композиции и редкие углеводы.

После освоения эта техника может быть выполнена для 386 штаммов всего за пять часов. После этой процедуры могут быть включены дополнительные анализы, такие как уже существующий пируват или дополнительные анализы на ацетаты или фосфаты, чтобы ответить на дополнительный вопрос о декларировании экзополисахаридов. После своего развития этот метод, благодаря своей высокой чувствительности, проложил путь для наших исследований в области генно-инженерных микробных продуцентов экзополисахаридов для изучения влияния измененных путей биосинтеза экзополисахаридов на живую химическую структуру.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как очень быстро и надежно идентифицировать новых производителей экзополисахаридов.