Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

Общая цель данной процедуры заключается в получении ненуклеарной фракции, обогащенной репликационными компартментами, которые образуются в клетках, инфицированных аденовирусом, для детального изучения их состава, ультраструктуры и связанной с ними активности. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области вирусологии ДНК, таких как изучение молекулярных механизмов, контролирующих репликацию и экспрессию вирусного генома, которые, в свою очередь, зависят от репликационных компартментов для регуляции взаимодействий вируса с клеткой-хозяином. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой простую процедуру, основанную на градиенте плотности, для создания бесклеточной системы, пригодной для изучения механизмов, позволяющих ДНК-содержащим вирусам с ядерной репликацией брать под контроль инфицированную клетку.

Для проведения данного анализа сначала подготовьте аденовирус 5-го типа (Ad5) и фибробласты крайней плоти человека (HFF) согласно прилагаемому текстовому протоколу. Для начала заразите 10⁷ HFF в 100-мм чашках для культивирования тканей, используя 1 мл DMEM на чашку при множественности заражения (MOI) 30 фокус-формирующих единиц (FFU) на клетку. Инкубируйте клетки в течение двух часов в увлажненном инкубаторе для культур клеток при 37 °C и 5% CO2, аккуратно покачивая чашки каждые 15 минут для обеспечения гомогенного распределения вирусного инокулята по клеткам. После инкубации удалите среду и добавьте свежий DMEM.

Добавьте 10% FBS, затем инкубируйте клетки в течение 16, 24 или 36 часов, после чего используйте скребок для клеток. Осторожно соберите инфицированные и контрольные клетки после инфицирования и перенесите клеточную суспензию в стерильные центрифужные пробирки на льду. Подсчитайте количество клеток с помощью камеры Нойбауэра, а затем центрифугируйте клетки при 220 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в 5 мл ледяного PBS, центрифугируйте и промойте клетки трижды в 5 мл ледяного PBS, удаляя супернатант после каждой промывки, чтобы подготовить клетки к лизису. Ресуспендируйте осадок клеток в 700 µL ледяного гипотонического буфера с ингибиторами протеаз и оставьте клетки на льду на три часа для набухания. Используя тефлоновый пестик типа A, гомогенизируйте клетки, совершив 10–20 движений вниз.

Периодически, каждые 20 нажатий, проверяйте лизат под микроскопом для контроля лизиса клеток. Повторяйте процедуру примерно до 80 нажатий, пока все клетки не будут успешно разрушены. Затем центрифугируйте гомогенат при 300 ×g при температуре 4 °C в течение пяти минут.

Храните супернатант при минус 20 °C в пробирке в качестве цитоплазматической фракции, чтобы удалить клеточный дебрис из ядерных остатков. Ресуспендируйте осадок в 750 µL 0,25 M раствора сахарозы (раствор один); налейте в центрифужную пробирку 750 µL 0,35 M раствора сахарозы (раствор два) и осторожно наслоите ресуспендированный гомогенат поверх раствора два. Центрифугируйте сахарозную подушку при 1400 ×g при 4 °C в течение пяти минут, затем удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок в 750 µL раствора два для лизиса ядер. Соникатируйте ядерную суспензию в ультразвуковой бане при температуре не выше 4 °C двумя импульсами по пять минут. Проверяйте лизис ядер с помощью микроскопа с проходящим светом между импульсами и продолжайте соникацию до полного лизиса ядер.

Затем дозируйте пипеткой 750 µL 0,88 M раствора сахарозы (раствор три) в центрифужную пробирку и аккуратно нанесите раствор ядерного лизата поверх раствора три. Центрифугируйте лизат при 3000 ×g при температуре 4 °C в течение 10 минут. Полученный супернатант объемом 1,5 мл представляет собой нуклеоплазматическую фракцию, которую следует хранить при температуре -70 °C.

Затем ресуспендируйте осадок в 700 µL раствора два. Это фракция репликационного компартмента 85 (RCF) ядра хозяина, которая также хранится при -70 °C. Для начала иммунофлуоресцентного анализа нанесите каплю RCF объемом 5 µL на предметное стекло, покрытое солевым раствором.

Дайте капле высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Затем нанесите 500 µL PBS каплей рядом с пятном и наклоните предметное стекло, чтобы PBS прошла через пятно. Слейте PBS с предметного стекла.

Затем заблокируйте пятно образца, добавив 500 µL PBS, содержащего 5% бычьего сывороточного альбумина, на два часа при комнатной температуре. Чтобы удалить излишки блокирующего раствора, осторожно добавьте 500 µL PBS к нанесенному на предметное стекло образцу, избегая прямого дозирования пипеткой на образец. Повторите промывку три раза.

Затем нанесите 20 µL разведенного первичного антитела к вирусному ДНК-связывающему белку E2A на область образца. Накройте предметное стекло, чтобы предотвратить испарение, и инкубируйте в увлажненной камере при комнатной температуре в течение двух часов. После этого трижды осторожно промойте образец буфером PBS, содержащим 0,02% tween 20.

После этих промывок избегайте дозирования пипеткой непосредственно на образец. Нанесите 20 µL вторичных антител к мыши, конъюгированных с флуорофором 4, непосредственно на образец, инкубируйте при 4 °C в течение одного часа. В увлажненной камере добавьте на предметные стекла 500 µL PBS с 0,02% Tween 20, снова избегая дозирования пипеткой непосредственно на образец.

Затем добавьте 2 µL фиксирующего раствора и накройте образец покровным стеклом. Загерметизируйте края покровного стекла лаком для ногтей. Рассматривайте препарат под флуоресцентным микроскопом с объективом 63x на длине волны, соответствующей используемому флуорофору; здесь представлен результат иммунофлуоресцентного анализа аденовирусного белка E2A, связывающего ДНК (DBP).

Структуры, содержащие DBP, представляют собой субнуклеарные вирусные RC; обратите внимание, что E2A DBP локализован внутри RC и окрашен в зеленый цвет. Кроме того, обогащение вирусной ДНК в RCF было подтверждено с помощью ПЦР путем сравнения RCF и нуклеоплазматической фракции (NPL) через 24 и 36 часов после инфицирования. Вирусная ДНК была селективно обнаружена в RCF и отсутствовала в NPL.

Сопровождающий текст содержит дополнительные доказательства наличия аденовирусного MNA в RCF. После освоения данной техники время от сбора инфицированных клеток до выделения RCF может составить шесть часов при условии правильного выполнения процедуры. При выполнении данного протокола важно помнить о необходимости постоянно содержать образцы на льду и контролировать этапы гомогенизации ядер, выделения, соникации и выделения субъядерной фракции с помощью микроскопии в светлом поле. Следуйте данной процедуре.

Для изучения регуляции экспрессии вирусных генов, связанной с компартментами вирусной репликации, а также ультраструктуры этих частиц могут быть использованы другие методы, такие как ОТ-ПЦР и просвечивающая электронная микроскопия. Данная методика может открыть перед исследователями в области вирусологии ДНК-содержащих опухолевых вирусов возможности для изучения молекулярных механизмов, которые изменяют регуляцию клеточного цикла и стимулируют репликацию вируса в клетках человека. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать компартменты вирусной репликации из ядер инфицированных клеток для проведения морфологических, функциональных и композиционных исследований этих индуцированных вирусом структур.

Не забывайте, что работа с индикатором SAN может быть опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств защиты органов слуха.