Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

Общей целью данной процедуры является получение безъядерной фракции, обогащенной репликационными компартментами, образующимися в инфицированных аденовирусом клетках, для детального изучения их состава, ультраструктуры и связанной с этим активности. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области ДНК-вирусологии, таких как изучение молекулярных механизмов, контролирующих репликацию и экспрессию вирусного генома, которые, в свою очередь, зависят от репликационных компартментов для регуляции взаимодействий вирусных клеток-хозяев. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это простая процедура, основанная на градиенте скорости, для создания бесклеточной системы, которая поддается изучению механизмов, позволяющих вирусам с ядерной репликацией ДНК брать под контроль инфицированную клетку.

Для проведения этого анализа, во-первых, подготовьте аденовирус пятого типа или D 5 и фибробласты крайней плоти человека или HFF, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы начать инфекцию от 10 до 7 HFF в 100-миллиметровых чашках для культуры тканей с использованием одного миллилитра 85 и DMM на чашку с MOI 30 фокусообразующих единиц или FFU на клетку. Инкубируйте клетки в течение двух часов в инкубаторе увлажненных клеточных культур. при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Осторожно покачивая посуду каждые 15 минут, чтобы обеспечить равномерное распределение вирусного инокулюма по клеткам. После инкубации удалите среду и добавьте свежий дмем.

С добавлением 10% FBS инкубируйте клетки в течение 16, 24 или 36 часов с помощью скребка для клеток. Аккуратно соберите инфицированные и контрольные клетки после заражения и соберите клеточную суспензию в стерильные центрифужные пробирки на льду. Подсчитайте ячейки с помощью нейбауэровой камеры, а затем центрифугируйте ячейки при температуре 220 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах ледяной центрифуги PBS и трижды промойте клетки в пяти миллилитрах ледяной PBS, отбросив надосадочную жидкость для промывки, чтобы заразить клетки. Восстановите суспензию клеточной гранулы в 700 микролитрах ледяного гипотонического буфера с ингибиторами протеазы и дайте клеткам набухнуть на льду в течение трех часов. С помощью тефлонового пестика типа А гомогенизируйте клетки от 10 до 20 нисходящих ударов.

Периодически проверяйте лизат под микроскопом каждые 20 штрихов, чтобы контролировать лизис клеток. Повторяйте процесс около 80 ударов, пока все клетки не будут успешно разорваны. Затем центрифугируйте гомогенат при 300 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Храните надосадочную жидкость при температуре минус 20 градусов Цельсия в пробирке в качестве цитоплазматической фракции для удаления клеточного мусора из ядер reus. Суспендируйте гранулу в 750 микролитрах 0,25 молярного раствора сахарозы, одну пипетку, 750 микролитров 0,35 молярного раствора сахарозы две в центрифужную пробирку и тщательно выложите ресуспендированный гомогенат поверх второго раствора. Вращайте подушку из сахарозы при температуре 1400 °G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в 750 микролитрах раствора двух до вшей. Ядра обрабатывают ядерную суспензию ультразвуком в ультразвуковой ванне, поддерживаемой на уровне четырех градусов Цельсия или ниже, в течение двух пятиминутных импульсов. Проверьте ядерный лизис под светлопольным микроскопом между импульсами и произведите ультразвуковую обработку дальше до полного залегания ядер

Далее пипеткой 750 микролитров 0,88 моляра раствора сахарозы три в центрифужной пробирке слой раствора ядерного лизата поверх раствора три. Центрифугируйте лизат при 3000 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Названный 1,5 миллилитровый S является ядроплазменной фракцией, которая хранится при температуре минус 70 градусов по Цельсию.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 700 микролитрах раствора двух. Это 85 репликационная компартментная фракция или RCF ядра хозяина, которая также хранится при температуре минус 70 градусов Цельсия. Чтобы начать иммунофлуоресцентный анализ, добавьте каплю RCF объемом пять микролитров в предметное стекло, покрытое солевым раствором.

Дайте капле высохнуть при комнатной температуре. Затем добавьте 500 микролитров PBS в каплю рядом с пятном и наклоните предметное стекло, чтобы PBS протекала по пятну. Слейте PBS из предметного стекла.

Затем заблокируйте пробное пятно 500 микролитрами PBS, содержащими 5% бычьего сывороточного альбумина, на два часа при комнатной температуре. Чтобы удалить избыток блокирующего раствора, аккуратно добавьте 500 микролитров PBS в образец, пятнистый на предметном стекле, без пипетирования непосредственно на образце. Выполните стирку три раза.

Далее добавьте 20 микролитров разведенного первичного антитела против вирусного белка, связывающего ДНК Е-2-А, на месте образца. Накройте предметное стекло во избежание испарения и выдерживайте во влажной камере при комнатной температуре в течение двух часов. Теперь трижды аккуратно промойте образец PBS, содержащим 0,02% от 20.

Избегайте пипетирования непосредственно на образце после этих промывок. Добавьте 20 микролитров вторичного антитела к мышам с фторсодержащими четырьмя парами непосредственно на образец, инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. В увлажненную камеру добавьте 500 микролитров PBS с 0,02% Tween 20 в предметные стекла, опять же, избегая пипетирования непосредственно на образце.

Затем добавьте два микролитра монтажного раствора и переверните покровное стекло над образцом. Заклейте боковые стороны покровных накладных лаком для ногтей. Посмотрите на предметное стекло под флуоресцентным микроскопом с объективом 63 x на желаемой длине волны, специфичной для используемого флюорочетвера, результат иммунофлуоресценции аденовирусного белка Е-2-А, связывающего ДНК или ДАБ, показан здесь.

Структуры, содержащие DBP, являются субъядерными вирусными RC, обратите внимание, что E two A DBP локализован внутри RC и отображается зеленым цветом. Кроме того, обогащение вирусной ДНК в РКЛ было подтверждено методом ПЦР, сравнивая РКФ и ядерно-плазматическую фракцию или НЧЛ через 24 и 36 часов после заражения. Вирусная ГНК была выборочно обнаружена в RCF, а не в консультации NPL.

Сопроводительный текст для получения дополнительных доказательств наличия аденовирусной МНК в RCF Как только вы освоите этот метод, его можно выполнить за шесть с момента сбора инфицированных клеток до выделения RCF, если он выполнен правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что образцы всегда должны находиться на льду и контролировать этапы гомогенизации ядра, выделения, ультразвука и выделения субядерной фракции с помощью микроскопии в светлом поле. Следуя этой процедуре.

Другие методы, такие как R-T-P-C-R и просвечивающая электронная микроскопия, могут быть выполнены для изучения регуляции экспрессии вирусных генов, связанных с компартментами репликации вируса и ультраструктурой этих частиц. Этот метод может проложить путь исследователям в области вирусологии ДНК-опухолей к изучению молекулярных механизмов, которые изменяют регуляцию клеточного цикла и способствуют репликации вируса в клетках человека. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить вирусные репликационные компартменты из инфицированных клеточных ядер для проведения морфологических, функциональных и композиционных исследований этих вирусных индуцированных структур.

Не забывайте, что работа с индикатором SAN может быть опасной, и во время выполнения этой процедуры всегда следует учитывать ударные нагрузки, такие как ношение ушного рта.