Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе

Общая цель данного протокола — описать изготовление проточного трипсинового микрореактора, который обеспечивает быстрое ферментативное расщепление белков для их последующей идентификации с помощью масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Этот метод позволяет определить аминокислотную последовательность выделенных и очищенных белков для дальнейшего анализа их структуры и функции. Основным преимуществом данного протокола является его высокая скорость, экономическая эффективность и пригодность для интеграции в рабочие процессы, использующие микрофабрикованные платформы.

Для начала с помощью резака для стеклянных капилляров разрежьте большой стеклянный капилляр до длины семь-восемь сантиметров, а меньший — до длины три-пять сантиметров. С помощью микроскопа убедитесь, что оба конца капилляров имеют чистый ровный срез без выступающих заусенцев. Вставьте меньший капилляр примерно на шесть миллиметров в один из концов большего капилляра.

Затем с помощью ватной палочки нанесите небольшую каплю клея вокруг места соединения капилляров и оставьте клей для отверждения на ночь при комнатной температуре. После этого обрежьте вставленный капилляр до длины примерно 10–15 мм. Этот конец будет служить эмиттером для ионизации электрораспылением.

Вставьте противоположный конец капилляра большего диаметра в трубку из PEEK диаметром 1/32 дюйма, предварительно обрезанную до длины от четырех до пяти сантиметров и соединенную с соединителем PEEK. Затем вставьте и затяните отрезок трубки из PTFE длиной пять сантиметров и диаметром 1/16 дюйма в противоположный конец соединителя. В чистом сухом стеклянном флаконе объемом два миллилитра отвесьте четыре миллиграмма частиц C18, а затем добавьте 0.5 миллилитров изопропанола.

Закройте флакон. Поместите его в ультразвуковую баню и проведите соникацию для равномерного распределения частиц в растворе. Затем с помощью шприца объемом 250 µL наберите 200 µL суспензии C18.

Вставьте шприц в PTFE-трубку диаметром 1/16 дюйма и медленно введите суспензию в большой капилляр. Наблюдайте под микроскопом за заполнением капилляра частицами до тех пор, пока слой упаковки частиц не достигнет двух-трех миллиметров. Меньший капилляр удерживает эти частицы в микрореакторе за счет эффекта клина (keystone effect).

Наконец, промойте микрореактор 50 µL раствора воды и ацетонитрила в соотношении 50:50, затем 50 µL раствора, содержащего 49 µL воды, смешанной с 1 µL ацетонитрила. Отсоедините капиллярный микрореактор от соединителя PEEK и подключите его к Т-образному соединителю PEEK. Затем в боковой канал Т-образного соединителя PEEK вставьте платиновую проволоку длиной два сантиметра, изолированную гильзой PEEK диаметром 1/32 дюйма для обеспечения герметичного соединения.

Подсоедините капилляр для переноса образца длиной полметра к противоположному концу PEEK-T. Для обеспечения герметичности соединения используйте трубку (гильзу) из PEEK диаметром 1/32 дюйма. Закрепите PEEK-T на столике XYZ.

Расположите эмиттер электроспрей-ионизации примерно в двух миллиметрах от входного капилляра масс-спектрометра. Затем подсоедините платиновую проволоку к источнику питания электроспрей-ионизации масс-спектрометра. Также подсоедините противоположный конец капилляра для переноса образца к соединителю из нержавеющей стали, используя PEEK-втулку диаметром 1/16 дюйма для обеспечения герметичного соединения.

Затем подсоедините отрезок ПТФЭ-трубки длиной от четырех до пяти сантиметров и диаметром 1/16 дюйма к противоположному концу стальной соединительной муфты. Введите параметры сбора данных тандемной масс-спектрометрии (МС), описанные в прилагаемом текстовом протоколе, в программное обеспечение, управляющее масс-спектрометром. Сохраните их в виде файла метода, чтобы подготовить систему к проведению анализа.

Система LTQ MS оснащена модифицированным источником ESI, который включает в себя собранный вручную XYZ-столик, позволяющий сопрягать масс-спектрометр с различными способами ввода образца. Заполните шприц объемом 250 µL водным раствором 50 mM бикарбоната, растворенного в 2% ацетонитрила. Затем подсоедините шприц к микрореактору и установите его в шприцевой насос.

Промойте микрореактор потоком 2 µL/min в течение 5 минут, чтобы подготовить его к анализу. Затем наберите исследуемый образец белка в шприц объемом 250 µL и введите раствор образца со скоростью 2 µL/min в течение 5 минут. Далее поместите под шприцевой насос шприц объемом 250 µL с 5 µM раствором трипсина и введите его поверх абсорбированного белка в микрореакторе со скоростью 2 µL/min в течение 1–3 минут.

Крайне важно размораживать и готовить раствор трипсина непосредственно перед каждым экспериментом. Это обеспечит сохранение активности протеолитического фермента и поддержание рабочего pH микрореактора, который составляет около 8. Заполните еще один шприц объемом 250 µL водным раствором, состоящим из 0%1% трифторуксусной кислоты, добавленной к 2% ацетонитрилу.

Используйте данный раствор для остановки процесса протеолитического расщепления, промывая микрореактор со скоростью 2 µL/min в течение пяти минут. Затем переключитесь на шприц, заполненный 0,1% трифторуксусной кислотой в 50% ацетонитриле, и запустите процесс сбора данных МС, установив напряжение ионизации электрораспылением примерно на 2000 V. Используйте подкисленный раствор для элюирования продуктов расщепления белка из микрореактора со скоростью 300 nL/min в течение 20–30 минут.

Соберите данные масс-спектрометрии, используя параметры сбора данных, указанные в прилагаемом текстовом протоколе. Обработайте исходные файлы LTQ MS, используя минимально избыточную базу данных белков, предварительно загрузив исходные данные в поисковый движок. Затем установите допуски по массе родительского и фрагментного ионов на два и один дальтон соответственно и используйте для поиска только полностью триптические фрагменты с количеством пропущенных расщеплений не более двух.

Кроме того, установите уровни ложноположительных результатов (FDR) для высокого и среднего уровней достоверности на 1% и 3% соответственно, и не допускайте посттрансляционных модификаций, если только вы не ищете конкретные модификации. Наконец, отфильтруйте данные, чтобы выбрать только высокодостоверные совпадения пептидов. Здесь представлен масс-спектр, состоящий из триптических пептидов, полученных из смеси белков, подвергнутой протеолизу в микрореакторе.

Эти метки обозначают наиболее интенсивные ионы триптических пептидов и содержат их последовательность и соответствующий идентификатор белка. Данный микрореактор обеспечивает простую в реализации установку для проведения ферментативного переваривания белков и позволяет выполнить масс-анализ и идентификацию менее чем за 30 минут. При выполнении данной процедуры важно помнить, что поддержание чистоты флаконов и оборудования, контактирующего с растворами, имеет решающее значение для предотвращения загрязнения образцов.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы сбора данных масс-спектрометрии для более детальной характеристики образующихся пептидов и получения ответов на дополнительные вопросы, касающиеся структуры белков. После разработки эта методика открыла исследователям в области протеомики путь к созданию более быстрых протоколов анализа белков и изучению новых микроаналитических платформ, обеспечивающих высокопроизводительный анализ биологических образцов. Данный метод ограничен анализом относительно простых белковых смесей, которые дают от 25 до 50 пептидов.

Эти пептиды можно анализировать с помощью простых экспериментов по инфузии, что исключает необходимость жидкостного хроматографического разделения перед масс-спектрометрическим анализом. Не забывайте, что работа с органическими растворителями может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как исключение использования открытого огня.