Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы описать создание проточного триптического микрореактора, который осуществляет быстрое ферментативное расщепление белков для обеспечения идентификации белков с помощью масс-спектрометра с электронным распылением ионизации. Этот метод может помочь проиллюстрировать аминокислотную последовательность выделенных и очищенных белков для поддержки последующей характеристики структуры и функции. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он быстрый, экономичный и подвержен интеграции в рабочие процессы, использующие микропроизводственные платформы.

Для начала с помощью стеклянного капиллярного скалывателя разрежьте большую стеклянную капиллярную трубку до длины семь-восемь сантиметров, а меньшую – до длины от трех до пяти сантиметров. С помощью микроскопа убедитесь, что оба конца капилляра имеют чистый, прямой срез, без выступающих заусенцев. Вставьте меньший капилляр примерно на шесть миллиметров в один конец большого.

Затем с помощью ватной палочки нанесите небольшую каплю клея вокруг соединения капилляров и дайте клею застыть в течение ночи при комнатной температуре. Далее разрежьте вставленный капилляр на длину примерно от 10 до 15 миллиметров. Этот конец будет действовать как излучатель ионизации электроспреем.

Вставьте противоположный конец капилляра большего диаметра в трубку PEEK диаметром 1/32 дюйма, которая была предварительно вырезана длиной от четырех до пяти сантиметров и соединена с соединением PEEK. Затем вставьте и затяните пятисантиметровый кусок трубки из ПТФЭ 1/16 в противоположный конец соединения. В чистой, сухой двухмиллилитровой стеклянной пилке взвесьте четыре миллиграмма частиц C18, а затем добавьте 0,5 миллилитров изопропанола.

Закройте флакон. Поместите его в ванну ультразвукового аппарата и обработайте ультразвуком, чтобы равномерно распределить частицы в растворе. Далее с помощью шприца объемом 250 микролитров наберите 200 микролитров суспензии C18.

Вставьте шприц в трубку из ПТФЭ диаметром 1/16 дюйма и медленно выдайте суспензию в большой капилляр. Наблюдайте под микроскопом, как капилляр заполняется частицами, пока не будет достигнуто двух-три миллиметра упаковки частиц. Капиллярная трубка меньшего размера удерживает эти частицы в микрореакторе за счет эффекта трапецеидальных искажений.

Наконец, промойте микрореактор 50 микролитрами раствора воды и ацетонитрила в соотношении 50 на 50, а затем 50 микролитрами раствора, содержащего 49 микролитров воды, смешанных с одним микролитром ацетонитрила. Отсоедините капиллярный микрореактор от штуцера PEEK и подключите его к PEEK-T. Затем вставьте двухсантиметровый платиновый провод, изолированный гильзой PEEK 1/32 дюйма, чтобы обеспечить герметичное соединение, в боковой рычаг PEEK-T.

Подсоедините капилляр для переноса проб длиной полметра к противоположному концу PEEK-T. Используйте втулку PEEK диаметром 1/32 дюйма для обеспечения герметичного соединения. Закрепите PEEK-T на столике XYZ.

И расположите ионизационный излучатель электроспрея примерно в двух миллиметрах от входного капилляра масс-спектрометра. Затем подключите платиновую проволоку к источнику питания ионизации электрораспылением масс-спектрометра. Кроме того, подсоедините противоположный конец капилляра для переноса проб к штуцеру из нержавеющей стали с помощью 1/16-дюймовой муфты PEEK для обеспечения герметичного соединения.

Затем подсоедините кусок трубки из ПТФЭ длиной от четырех до пяти сантиметров длиной 1/16 дюйма к противоположному концу соединения из нержавеющей стали. Введите параметры сбора данных тандемной МС, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, в программный пакет, управляющий прибором МС. Сохраните их в виде файла метода, чтобы подготовить настройку для выполнения анализа.

Система LTQ MS оснащена модифицированным источником ESI, который включает в себя самодельный столик XYZ, который позволяет подключать масс-спектрометр к различным подходам к вводу образца. Загрузите в шприц объемом 250 мкл водный раствор 50 миллимолярного бикарбоната, растворенного в 2%-ном ацетонитриле. Затем подключите шприц к микрореактору и поместите его под шприцевой насос.

Промойте микрореактор и сделайте два микролитра в минуту в течение пяти минут, чтобы подготовить его к анализу. Затем загрузите интересующий вас образец белка в шприц объемом 250 микролитров и настаивайте в растворе образца со скоростью два микролитра в минуту в течение пяти минут. Затем поместите шприц объемом 250 микролитров, загруженный пятью микромолярными растворами трипсина, под шприцевой насос и вливайте поглощенный белок в микрореакторе со скоростью два микролитра в минуту в течение одной-трех минут.

Очень важно, чтобы перед каждым экспериментом вы только что разморозили и приготовили раствор трипсина. Это гарантирует, что протолитический фермент сохранит свою активность и рабочий pH микрореактора, который составляет pH около 8. Загрузите еще 250 микролитровый шприц водным раствором, состоящим из 0%1% трифторуксусной кислоты, добавленной к 2%-ному ацетонитрилу.

Используйте этот раствор для гашения процесса протеолитического разложения путем промывки микрореактора со скоростью два микролитра в минуту в течение пяти минут. Затем переключитесь на шприц, наполненный 01% трифторуксусной кислотой, добавленной к 50% ацетонитрила, и включите процесс сбора данных MS в напряжении ионизации электрораспылением примерно до 2000 вольт. Используйте подкисленный раствор, чтобы начать элюирование белка из микрореактора со скоростью 300 нанолитров в минуту в течение 20-30 минут.

Получение массовых данных с использованием параметров сбора данных, предоставленных в сопроводительном текстовом протоколе. Обрабатывайте необработанные файлы LTQ MS с использованием базы данных белков с минимальным резервированием, предварительно загрузив необработанные данные в поисковую систему. Затем установите допуски по массе ионов родителя и фрагмента на две и одну дальтону соответственно и используйте для поиска только полностью триптические фрагменты с двумя пропущенными расщеплениями.

Кроме того, установите уровень ложных обнаружений с высокой и средней достоверностью на уровне 1% и 3% соответственно и не допускайте посттрансляционных изменений, если только они специально не ищут конкретные модификации. Наконец, отфильтруйте данные, чтобы выбрать только совпадения пептидов с высокой степенью достоверности. Здесь показан масс-спектр, состоящий из триптических пептидов, которые были получены из белковой смеси, подвергнутой протеолизу в микрореакторе.

Эти метки представляют наиболее интенсивные ионы триптических пептидов и обеспечивают их последовательность и соответствующий идентификатор белка. Этот микрореактор представляет собой простую в реализации экспериментальную установку для проведения ферментативного расщепления белков и позволяет проводить массовый анализ и идентификацию менее чем за 30 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить, что сохранение чистоты флаконов и инструментов, контактирующих с растворами, имеет решающее значение для предотвращения загрязнения пробы.

После этой процедуры можно использовать другие методы получения данных масс-спектрометрии, чтобы лучше охарактеризовать генеративные пептиды и ответить на дополнительные вопросы, связанные со структурой белков. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области протеономики к разработке более быстрых протоколов для анализа белков и изучению разработки новых микрофалитических платформ, которые обеспечивают высокую производительность исследования биологических образцов. Эта методика ограничивается анализом довольно простых белковых смесей, которые генерируют от 25 до 50 пептидов.

Эти пептиды могут быть проанализированы с помощью простых инфузионных экспериментов и не требуют хроматографического разделения жидкости перед анализом МС. Не забывайте, что работа с органическими растворителями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как избегание открытого огня.