Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка
November 6th, 2009
Цифровой Microfluidics это техника характеризуется манипуляции дискретных капель (~ NL - мл) на массив электродов с применением электрических полей. Она хорошо подходит для проведения быстрых, последовательных, миниатюрных автоматизированных биохимических анализов. Здесь мы сообщаем платформы, способной автоматизировать несколько протеомных шагов обработки.
Клиническая протеомика является важной новой дисциплиной, обещающей открытие биомаркеров, которые будут полезны для ранней диагностики и прогнозирования заболеваний. В этой статье мы сообщаем о новом цифровом методе микрофлюидики или DMF, объединяющем несколько этапов обработки, используемых в клинической протеомике, включая экстракцию белка, снижение ресолюбилизации, алкилирование и ферментативное расщепление. DMF использует дискретные микрокапли белков образцов на массиве электродов и может работать при комнатной температуре, что позволяет проводить параллельный автоматический анализ образцов.
Эта методология представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с традиционными методами и может стать новым полезным инструментом в клинической протеомике. Здравствуйте, я Стив Ше из лаборатории профессора Эрин Уилер на факультете химии и Института биоматериалов и биомедицинской инженерии Университета Торонто. Привет, я Габриэль из лаборатории Уилера в Университете Торонто.
Меня зовут Вивиан Люк, я тоже из лаборатории Wearer в Университете Торонто. Меня зовут Эрин Уилер. Мне повезло работать со Стивом Мейсом и Вивиан.
Сегодня мы покажем вам процедуру протеомной обработки с помощью цифровой микрофлюидики. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения белков и биологических образцов. Итак, приступим.
Начните процедуру в вытяжном шкафу с очистки стеклянных подложек в растворе «Пиранья». При ношении достаточной защиты, раствор пираньи состоит из концентрированной серной кислоты в соотношении 30% перекиси водорода. Так что при работе с ним следует соблюдать осторожность.
Инкубируйте стеклянные подложки в пираньях в течение 10 минут, а после очистки промойте их, деионизируйте или удалите воду и высушите субстраты газообразным азотом. Поместите подложки внутрь электронно-лучевой испарительной камеры для осаждения хрома до толщины 250 нанометров. Как только будет достигнута эта толщина, удалите подложки из камеры и промойте изопропанолом, затем высушите на горячей плите в течение пяти минут при температуре 115 градусов Цельсия.
Загрунтуйте высушенные подложки гексаметилксилазином или HMDS путем нанесения спинового покрытия в течение 30 секунд. 3000 об/мин снова прокрутите код с помощью фотографии Shipley S 1811. Противостоит с использованием идентичных параметров.
Предварительно запекайте основание прямо на горячей плите при температуре 100 градусов Цельсия минут. Затем смоделируйте фоторезист воздействием ультрафиолетового или ультрафиолетового излучения в течение пяти секунд через фотомаску. Затем проявите подложки, подверженные воздействию ультрафиолета, в проявителе Shipley MF 3 21 Достаточно погрузить подложку на три минуты после этого.
Промойте основание в столбе деионизированной воды. Выпекайте прямо на горячей плите при температуре 100 градусов Цельсия в течение одной минуты. Протравите открытый хром, погрузив подложки на 30 секунд в травление, достаточное для полного их покрытия.
Промойте основание деионизионной водой и погрузите в стриппер Z 300 T на 10 минут. Удалить остатки фоторезиста. Промойте в деионизированной воде и высушите в газообразном азоте.
После этого осаждения, от двух до пяти микрометров Paraline C. Изолирующий полимер на подложку методом химического осаждения из газовой фазы наносит 50 нанометров тефлона AF, чтобы сделать поверхность гидрофобной путем спинового покрытия раствора. 1% веса на вес во флоре нерва FC 40 при 2000 об/мин в течение 60 секунд. На подложку.
Повторите то же самое с непропущенным оксидом индия и олова или подложкой из стекла ITO, чтобы создать верхнюю стойку пластины. Запекайте обе подложки на горячей плите при температуре 160 градусов Цельсия. В течение 10 минут настраивайте цифровое микрофлюидное устройство.
Удалите полимерные покрытия с контактных площадок нижней подложки путем соскабливания скальпелем. Соедините открытые контактные площадки нижней подложки с 40-контактными разъемами для питания компьютера, работающего в лаборатории. Мы используем самодельный блок управления, который содержит реле с сигналами, управляемыми dpad.
Блок управления компьютером облегчает управление пользователем подачей на устройство 100 вольт RMS на 18 килогерц сигналов через 40-контактные разъемы. Также включите функциональный генератор и усилитель. Соберите устройство, расположив два куска двустороннего скотча общей толщиной 140 мкм по краям нижней подложки.
Нагрейте пипеткой четыре микролитра деионизированной воды в один из резервуаров и оберните устройство, расположив предметное стекло оксида индия и олова без рисунка на верхней части устройства стороной с тефлоновым покрытием вниз. Прикрепите разъем заземления к верхней пластине. Лаборатория создала программу инициализации в лабораторном виде для калибровки управления обратной связью, устройство теперь готово к экспериментам.
В этом протоколе мы будем использовать бычий сывороточный альбумин или BSA в качестве образца белка для демонстрации нашей цифровой микрофлюидики и ее использования. БСА разводят в рабочем буфере или ББ, изготовленном из 100 миллимолярного триса HCL pH 7,8 с 0,08% веса F1 27 на объем. Приготовьте по одному миллилитру каждого образца и раствора реагента и обозначьте резервуар, в который он будет добавлен.
После приготовления реагента снимите верхнюю пластину с прибора и влейте четыре микролитра раствора в отведенный ей резервуар. После заполнения бачков установите верхнюю пластину на устройство. Используйте собственную программу просмотра лабораторных работ для выполнения следующих шагов.
Помните, что компьютерный интерфейс позволяет пользователю дозировать около 600 нанолитровых капель из резервуаров и манипулировать каплями на массиве электродов. Сначала рассыпьте каплю белка, содержащую образец из R one, и каплю осадка из R two. Объедините две капли и дайте объединенной капле инкубироваться в течение пяти минут, чтобы белки выпали в осадок на поверхность.
Выведите надосадочную жидкость из осажденного белка в резервуар для отходов. R 3, чтобы промыть осажденный белок, дозируйте три капли буфера для промывки из R 4 и пропустите их через осажденный белок в резервуар для отходов. Дайте осадку высохнуть и выдавите каплю растворяющего буфера из R 5 на белок.
Дайте буферу поинкубироваться в течение 20 минут, пока осадок не растворится. Затем нанесите каплю восстановителя из R six и объедините ее с каплей образца. Смешайте объединенную каплю, приведя ее в действие на шести электродах по круговой схеме.
Дайте капле поинкубироваться в течение одного часа при комнатной температуре. Выдавите каплю алкилирующего агента из R семь и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Дайте капельке поинкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
Наконец, выведите каплю трипсина из R eight и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Дайте капле поинкубироваться в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия в чашке Петри на горячей плите. Чтобы закончить реакцию, снимите верхнюю пластину и утолите разложение с помощью пипетирования.
Нанесите шесть миллилитров 2,5%-ной трихлоруксусной кислоты в воде на реакционную каплю. Очистите закаленный продукт реакции, откачав каплю образца непосредственно из нижней пластины. Используя наконечник молнии C 18, в соответствии с инструкциями производителя, образцы теперь можно разбавлять по мере необходимости и оценивать с помощью масс-спектрометрии для идентификации белков в образце.
Затем были идентифицированы белки масс-спектра, с оценкой вероятности менее чем в один раз от E до отрицательных трех, что эквивалентно 99,9% доверительному интервалу и покрытию последовательностей не менее 30%. Итак, мы только что показали, как мы используем цифровую микрофлюидную технологию для извлечения и обработки белков в автоматическом режиме. Данная методология обеспечивает потенциальное решение проблемы потери и загрязнения проб во время выделения и идентификации белков.
Мы надеемся в будущем применить этот метод в других биологических приложениях, включая иммунологические анализы и клеточные анализы. При проведении такого рода экспериментов самое главное — не забывать получать от него удовольствие. Вот и все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье рассматривается новый метод цифровой микрогидродинамики (ЦМГ), который интегрирует несколько стадий обработки для клинической протеомики. Техника позволяет манипулировать микрокаплями на массиве электродов, обеспечивая автоматизированные биохимические анализы при комнатной температуре.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клиническая протеомика
- Биохимические анализы
- Цифровая микрогидродинамика
Предыстория
- Клиническая протеомика направлена на выявление биомаркеров для диагностики и прогноза заболеваний.
- Цифровая микрогидродинамика позволяет обращаться с дискретными капельками для биохимического анализа.
- Метод может работать при комнатной температуре, что улучшает обработку образцов.
- Автоматизация стадий обработки протеома является важной для повышения эффективности.
Цель исследования
- Представить новый метод ЦМГ для клинической протеомики.
- Интегрировать извлечение белков, солюбилизацию, редукцию, алкилирование и пищеварение.
- Демонстрировать преимущества ЦМГ перед конвенциональными методами.
Используемые методы
- Интеграция нескольких стадий обработки протеома с использованием ЦМГ.
- Использование дискретных микрокапель на массиве электродов.
- Автоматизация анализа образцов.
- Проведение экспериментов при комнатной температуре.
Основные результаты
- Метод ЦМГ успешно автоматизирует несколько стадий протеомики.
- Параллельный анализ образцов осуществляется эффективно.
- Методология показывает значительные улучшения по сравнению с традиционными техниками.
- Потенциал для широкого применения в клинической протеомике подчеркивается.
Выводы
- Новый метод ЦМГ представляет собой значительный прогресс в клинической протеомике.
- Он предлагает универсальный и эффективный подход для выявления биомаркеров.
- Будущие применения могут улучшить раннюю диагностику и прогноз заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Digital microfluidics (DMF) addresses a key bottleneck in clinical proteomics by automating multi-step protein processing workflows, reducing manual handling and associated variability. This enables reproducible, high-throughput preparation of samples for biomarker discovery, directly supporting early-stage target validation and assay development. By integrating extraction, solubilization, reduction, alkylation, and digestion on a single platform, DMF enhances predictive confidence in proteomic data generation for downstream R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through automated, reproducible protein sample preparation from complex biological fluids.
- Operational Value: Reduces manual pipetting steps, minimizing sample loss and contamination during upstream processing.
- Predictive Value: Supports biomarker identification with high sequence coverage and confidence scores, improving target selection reliability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitatively processable protein digests suitable for mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of multiple samples, increasing throughput for hit confirmation and lead profiling.
- Assay Readiness: Produces consistent enzymatic digestion outputs, enabling reliable compound evaluation in proteomic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase proteomics with preclinical validation by ensuring consistent sample preparation across study stages.
- Mechanistic De-risking: Reduces variability in post-translational modification analysis, supporting confident pathway elucidation.
- Predictive Confidence: Enables reproducible generation of proteomic datasets used to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
DMF fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven proteomics from initial target engagement through lead identification by delivering standardized, automation-ready sample inputs.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by enabling reproducible processing of disease-relevant protein samples from serum or cell lysates.
- Screening: Delivers assay-ready peptide mixtures with consistent digestion efficiency, enabling reliable LC-MS/MS readouts for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative, high-confidence proteomic outputs (e.g., sequence coverage >30%, probability scores <1e-3) that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Ensures sample preparation consistency from discovery through preclinical stages, supporting biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for automated proteomic processing across multiple projects, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein sample preparation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of proteomic workflows through automated droplet manipulation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent waste and enabling parallel sample processing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable, high-quality proteomic data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and electrode-based fluid control.
- Depends on access to microfabrication tools (e.g., spin coater, UV exposure system) and instrumentation for electrochemical actuation.
- Necessitates cross-team standardization of device preparation protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse sample types (e.g., serum, whole blood, cell lysates) due to varying viscosity and protein content.
- Practical limitations include the need for cleanroom-compatible fabrication steps and careful handling of hydrophobic surfaces to maintain droplet integrity.
