Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка

Клиническая протеомика — это важная новая дисциплина, которая открывает перспективы обнаружения биомаркеров, полезных для ранней диагностики и прогнозирования заболеваний. В данной работе мы представляем новый метод цифровой микрофлюидики (DMF), объединяющий несколько этапов обработки, используемых в клинической протеомике, включая экстракцию белков, их повторное растворение, восстановление, алкилирование и ферментативное переваривание. Метод DMF использует дискретные микрокапли белков образца на массиве электродов и может выполняться при комнатной температуре, что позволяет проводить параллельный автоматизированный анализ образцов.

Данная методика представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с традиционными методами и обладает потенциалом стать полезным новым инструментом в клинической протеомике. Здравствуйте, я Стив Ше из лаборатории профессора Эрин Уилер на кафедре химии и в Институте биоматериалов и биомедицинской инженерии Университета Торонто. Здравствуйте, я Габриэль из лаборатории Уилер в Университете Торонто.

А я Вивиан Люк, также из лаборатории Уилера в Университете Торонто. Я Эрин Уилер. Мне посчастливилось работать со Стивом Мейсом и Вивиан.

Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру протеомной обработки с использованием цифровой микрофлюидики. Мы применяем этот метод в нашей лаборатории для изучения белков и биологических образцов. Итак, приступим.

Начните процедуру в вытяжном шкафу с очистки стеклянных подложек в растворе Пиранья. Раствор Пиранья, при работе с которым необходимо использовать соответствующие средства защиты, состоит из концентрированной серной кислоты и 30% перекиси водорода в соотношении три к одному. В связи с этим при работе с данным реагентом следует соблюдать осторожность.

Инкубируйте стеклянные подложки в растворе «пиранья» в течение 10 минут, после очистки промойте их деионизированной водой и высушите потоком азота. Поместите подложки в камеру электронно-лучевого испарения для осаждения слоя хрома толщиной 250 nanometers. Извлеките подложки из камеры по достижении указанной толщины, промойте изопропанолом, затем высушите на нагревательном столе в течение пяти минут при 115 °C.

Подготовьте высушенные подложки, нанеся гексаметилдисилазан или HMDS методом центрифугирования в течение 30 секунд. Снова нанесите фоторезист Shipley S 1811 методом центрифугирования при 3000 RPM, используя те же параметры.

Проведите предварительный обжиг подложки непосредственно на нагревательном планшете при 100 °C в течение нескольких минут. Затем нанесите рисунок на фоторезист путем воздействия ультрафиолетового (УФ) облучения в течение пяти секунд через фотошаблон. После этого проявите облученные УФ подложки в проявителе Shipley MF 3 21, используя объем, достаточный для полного погружения подложки, в течение трех минут.

После этого промойте подложку в деионизированной воде. Просушите непосредственно на нагревательном столе при 100 °C в течение одной минуты. Удалите открытый хром, погрузив подложки на 30 секунд в раствор для травления хрома в объеме, достаточном для их полного покрытия.

Промойте подложки деионизированной водой и погрузите в стриппер Z 300 T в объеме, достаточном для полного погружения подложки, на 10 минут для удаления остатков фоторезиста. Промойте в деионизированной воде и высушите потоком азота.

После этого осаждения методом химического газофазного осаждения на подложку наносится изолирующий полимер Paraline C толщиной от двух до пяти микрометров. Затем методом центрифугирования раствора (1% масс./масс. в fluorinert FC 40 при 2000 об/мин в течение 60 секунд) на подложку наносится слой Teflon AF толщиной 50 нанометров для придания поверхности гидрофобности.

Повторите процедуру с непассивированным стеклянным субстратом с оксидом индия-олова или ITO для создания верхнего электрода. Прокалите оба субстрата на нагревательном планшере при 160 °C в течение 10 минут для сборки цифрового микрофлюидного устройства.

Удалите полимерное покрытие с контактных площадок нижнего субстрата, соскребая его скальпелем. Соедините открытые площадки нижнего субстрата с 40-контактными разъемами и включите компьютер с запущенным программным обеспечением LabVIEW. Мы используем блок управления собственной сборки, содержащий реле, сигналы которых управляются с помощью D-pad.

Блок компьютерного управления позволяет пользователю регулировать подачу сигналов с действующим значением напряжения 100 volts и частотой 18 kilohertz на устройство через 40-контактные разъемы. Также включите генератор функций и усилитель. Соберите устройство, зафиксировав два фрагмента двусторонней ленты общей толщиной 140 micrometer по краям нижней подложки.

Пипеткой внесите 4 µL деионизированной воды в один из резервуаров и закройте устройство, поместив сверху предметное стекло с оксидом индия-олова без рисунка тефлоновым покрытием вниз. Подключите заземляющий коннектор к верхней пластине. Запустите разработанную в лаборатории программу инициализации в LabVIEW для калибровки управления обратной связью; после этого устройство готово к проведению экспериментов.

В данном протоколе мы будем использовать бычий сывороточный альбумин или BSA в качестве белкового образца для демонстрации конструкции и принципа работы нашей системы цифровой микрофлюидики. BSA разводят в рабочем буфере или WB, состоящем из 100 мМ tris HCL pH 7.8 с добавлением 0.08% w/v nonidet F-1}. Приготовьте по одному миллилитру каждого образца и раствора реагента и обозначьте резервуар, в который они будут добавлены.

После подготовки реагентов снимите верхнюю пластину с устройства и внесите четыре микролитра раствора в соответствующий резервуар с помощью пипетки. После заполнения резервуаров установите верхнюю пластину обратно на устройство. Используйте внутреннюю программу LabVIEW для выполнения следующих шагов.

Помните, что компьютерный интерфейс позволяет пользователю дозировать капли объемом около 600 нанолитров из резервуаров и манипулировать ими на массиве электродов. Сначала дозируйте каплю образца, содержащего белок, из R one и каплю осадителя из R two. Объедините две капли и дайте объединенной капле инкубироваться в течение пяти минут, чтобы белки осадились на поверхность.

Переместите супернатант от осажденного белка в резервуар для отходов. Для промывки осажденного белка из R four дозируйте три капли промывочного буфера, пропустите их через осажденный белок в резервуар для отходов. Дайте осадку высохнуть, затем нанесите одну каплю буфера для ресольвилизации из R five на белок.

Выдержите буфер в течение 20 минут до полного растворения осадка. Затем нанесите каплю восстанавливающего агента из ячейки R6 и объедините ее с каплей образца. Перемешайте объединенную каплю, перемещая ее по кругу через шесть электродов.

Инкубируйте каплю в течение одного часа при комнатной температуре. Добавьте каплю алкилирующего агента из R семь и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Инкубируйте каплю в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Наконец, нанесите каплю трипсина из лунки R8 и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Инкубируйте каплю в течение трех часов при 37 °C в чашке Петри на нагревательной плитке. Для завершения реакции снимите верхнюю пластину и остановите процесс расщепления с помощью дозирования пипеткой.

Нанесите 0,6 мл 2,5% раствора трихлоруксусной кислоты в воде на каплю с реакционной смесью. Очистите продукт остановленной реакции, всасывая каплю образца непосредственно с нижней пластины. С использованием C 18 zip tip, согласно инструкциям производителя, образцы теперь можно разбавить по мере необходимости и проанализировать методом масс-спектрометрии для идентификации белков в образце с помощью данной системы.

После этого с помощью масс-спектрометрии были идентифицированы белки с показателями вероятности менее 1*10⁻³, что соответствует 99,9% доверительному интервалу, и покрытием последовательности не менее 30%. Таким образом, DMF является очень полезной методикой для автоматизированной обработки протеомных образцов. Сегодня мы продемонстрировали, как мы используем цифровые микрофлюидные устройства для автоматизированного извлечения и обработки белков. Эта методика предлагает потенциальное решение проблемы потери и загрязнения образцов в процессе изоляции и идентификации белков.

Мы надеемся применить этот метод в будущем в других областях биологии, включая иммуноанализы и клеточные анализы. При проведении экспериментов такого типа самое важное — не забывать получать от этого удовольствие. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.