Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка

Клиническая протеомика является важной новой дисциплиной, обещающей открытие биомаркеров, которые будут полезны для ранней диагностики и прогнозирования заболеваний. В этой статье мы сообщаем о новом цифровом методе микрофлюидики или DMF, объединяющем несколько этапов обработки, используемых в клинической протеомике, включая экстракцию белка, снижение ресолюбилизации, алкилирование и ферментативное расщепление. DMF использует дискретные микрокапли белков образцов на массиве электродов и может работать при комнатной температуре, что позволяет проводить параллельный автоматический анализ образцов.

Эта методология представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с традиционными методами и может стать новым полезным инструментом в клинической протеомике. Здравствуйте, я Стив Ше из лаборатории профессора Эрин Уилер на факультете химии и Института биоматериалов и биомедицинской инженерии Университета Торонто. Привет, я Габриэль из лаборатории Уилера в Университете Торонто.

Меня зовут Вивиан Люк, я тоже из лаборатории Wearer в Университете Торонто. Меня зовут Эрин Уилер. Мне повезло работать со Стивом Мейсом и Вивиан.

Сегодня мы покажем вам процедуру протеомной обработки с помощью цифровой микрофлюидики. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения белков и биологических образцов. Итак, приступим.

Начните процедуру в вытяжном шкафу с очистки стеклянных подложек в растворе «Пиранья». При ношении достаточной защиты, раствор пираньи состоит из концентрированной серной кислоты в соотношении 30% перекиси водорода. Так что при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Инкубируйте стеклянные подложки в пираньях в течение 10 минут, а после очистки промойте их, деионизируйте или удалите воду и высушите субстраты газообразным азотом. Поместите подложки внутрь электронно-лучевой испарительной камеры для осаждения хрома до толщины 250 нанометров. Как только будет достигнута эта толщина, удалите подложки из камеры и промойте изопропанолом, затем высушите на горячей плите в течение пяти минут при температуре 115 градусов Цельсия.

Загрунтуйте высушенные подложки гексаметилксилазином или HMDS путем нанесения спинового покрытия в течение 30 секунд. 3000 об/мин снова прокрутите код с помощью фотографии Shipley S 1811. Противостоит с использованием идентичных параметров.

Предварительно запекайте основание прямо на горячей плите при температуре 100 градусов Цельсия минут. Затем смоделируйте фоторезист воздействием ультрафиолетового или ультрафиолетового излучения в течение пяти секунд через фотомаску. Затем проявите подложки, подверженные воздействию ультрафиолета, в проявителе Shipley MF 3 21 Достаточно погрузить подложку на три минуты после этого.

Промойте основание в столбе деионизированной воды. Выпекайте прямо на горячей плите при температуре 100 градусов Цельсия в течение одной минуты. Протравите открытый хром, погрузив подложки на 30 секунд в травление, достаточное для полного их покрытия.

Промойте основание деионизионной водой и погрузите в стриппер Z 300 T на 10 минут. Удалить остатки фоторезиста. Промойте в деионизированной воде и высушите в газообразном азоте.

После этого осаждения, от двух до пяти микрометров Paraline C. Изолирующий полимер на подложку методом химического осаждения из газовой фазы наносит 50 нанометров тефлона AF, чтобы сделать поверхность гидрофобной путем спинового покрытия раствора. 1% веса на вес во флоре нерва FC 40 при 2000 об/мин в течение 60 секунд. На подложку.

Повторите то же самое с непропущенным оксидом индия и олова или подложкой из стекла ITO, чтобы создать верхнюю стойку пластины. Запекайте обе подложки на горячей плите при температуре 160 градусов Цельсия. В течение 10 минут настраивайте цифровое микрофлюидное устройство.

Удалите полимерные покрытия с контактных площадок нижней подложки путем соскабливания скальпелем. Соедините открытые контактные площадки нижней подложки с 40-контактными разъемами для питания компьютера, работающего в лаборатории. Мы используем самодельный блок управления, который содержит реле с сигналами, управляемыми dpad.

Блок управления компьютером облегчает управление пользователем подачей на устройство 100 вольт RMS на 18 килогерц сигналов через 40-контактные разъемы. Также включите функциональный генератор и усилитель. Соберите устройство, расположив два куска двустороннего скотча общей толщиной 140 мкм по краям нижней подложки.

Нагрейте пипеткой четыре микролитра деионизированной воды в один из резервуаров и оберните устройство, расположив предметное стекло оксида индия и олова без рисунка на верхней части устройства стороной с тефлоновым покрытием вниз. Прикрепите разъем заземления к верхней пластине. Лаборатория создала программу инициализации в лабораторном виде для калибровки управления обратной связью, устройство теперь готово к экспериментам.

В этом протоколе мы будем использовать бычий сывороточный альбумин или BSA в качестве образца белка для демонстрации нашей цифровой микрофлюидики и ее использования. БСА разводят в рабочем буфере или ББ, изготовленном из 100 миллимолярного триса HCL pH 7,8 с 0,08% веса F1 27 на объем. Приготовьте по одному миллилитру каждого образца и раствора реагента и обозначьте резервуар, в который он будет добавлен.

После приготовления реагента снимите верхнюю пластину с прибора и влейте четыре микролитра раствора в отведенный ей резервуар. После заполнения бачков установите верхнюю пластину на устройство. Используйте собственную программу просмотра лабораторных работ для выполнения следующих шагов.

Помните, что компьютерный интерфейс позволяет пользователю дозировать около 600 нанолитровых капель из резервуаров и манипулировать каплями на массиве электродов. Сначала рассыпьте каплю белка, содержащую образец из R one, и каплю осадка из R two. Объедините две капли и дайте объединенной капле инкубироваться в течение пяти минут, чтобы белки выпали в осадок на поверхность.

Выведите надосадочную жидкость из осажденного белка в резервуар для отходов. R 3, чтобы промыть осажденный белок, дозируйте три капли буфера для промывки из R 4 и пропустите их через осажденный белок в резервуар для отходов. Дайте осадку высохнуть и выдавите каплю растворяющего буфера из R 5 на белок.

Дайте буферу поинкубироваться в течение 20 минут, пока осадок не растворится. Затем нанесите каплю восстановителя из R six и объедините ее с каплей образца. Смешайте объединенную каплю, приведя ее в действие на шести электродах по круговой схеме.

Дайте капле поинкубироваться в течение одного часа при комнатной температуре. Выдавите каплю алкилирующего агента из R семь и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Дайте капельке поинкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.

Наконец, выведите каплю трипсина из R eight и объедините ее с каплей образца, после чего перемешайте. Дайте капле поинкубироваться в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия в чашке Петри на горячей плите. Чтобы закончить реакцию, снимите верхнюю пластину и утолите разложение с помощью пипетирования.

Нанесите шесть миллилитров 2,5%-ной трихлоруксусной кислоты в воде на реакционную каплю. Очистите закаленный продукт реакции, откачав каплю образца непосредственно из нижней пластины. Используя наконечник молнии C 18, в соответствии с инструкциями производителя, образцы теперь можно разбавлять по мере необходимости и оценивать с помощью масс-спектрометрии для идентификации белков в образце.

Затем были идентифицированы белки масс-спектра, с оценкой вероятности менее чем в один раз от E до отрицательных трех, что эквивалентно 99,9% доверительному интервалу и покрытию последовательностей не менее 30%. Итак, мы только что показали, как мы используем цифровую микрофлюидную технологию для извлечения и обработки белков в автоматическом режиме. Данная методология обеспечивает потенциальное решение проблемы потери и загрязнения проб во время выделения и идентификации белков.

Мы надеемся в будущем применить этот метод в других биологических приложениях, включая иммунологические анализы и клеточные анализы. При проведении такого рода экспериментов самое главное — не забывать получать от него удовольствие. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.