Разработка Backbone циклический пептид библиотека как потенциал Противопаразитарные терапии Использование микроволнового облучения

Общей целью данной процедуры является разработка сфокусированной циклической пептидомиметической библиотеки с конформационным разнообразием с использованием микроволнового облучения для разработки новых антипаразитарных препаратов. Этот метод может помочь в разработке новых инструментов для специфического нацеливания на белок-белковые взаимодействия. Чтобы начать эту процедуру, добавьте в полипропиленовый картридж 2,5 миллилитра нужной аминокислоты, один миллилитр активатора и 0,5 миллилитра основы активатора.

Поместите картридж в автоматический синтезатор микроволновой печи и дайте реакции сопряжения протекать в течение 300 секунд при мощности 25 Вт и температуре 75 градусов Цельсия. Как только реакция будет завершена, промойте смолу семью миллилитрами N, N-диметилформамида или ДМФА в течение 120 секунд при комнатной температуре. Повторив предыдущий шаг пять раз, добавьте семь миллилитров 20% пиперидина в DMF с 0,1 молярного 1-гидроксибензотриазола, или HOBt, в полипропиленовый картридж и инкубируйте в течение 30 секунд при мощности 45 Вт и 75 градусах Цельсия.

Когда закончите, слейте реакционную смесь. Далее добавьте в полипропиленовый картридж семь миллилитров 20%-ного пиперидина в ДМФА с 0,1 молярного HOBt и инкубируйте в течение 180 секунд при мощности 45 Вт и 75 градусах Цельсия. После слива реакционной смеси промойте смолу семью миллилитрами ДМФА в течение 120 секунд при комнатной температуре.

Затем промойте смолу семью миллилитрами дихлорметана, или DCM, в течение 120 секунд при комнатной температуре. Для соединения ангидридов промойте смолу семью миллилитрами 1-метил-2-пирролидинона, или NMP, в течение 120 секунд при комнатной температуре. Когда закончите, слейте реакционную смесь.

Повторив предыдущий шаг три раза, растворите 10 эквивалентов соответствующего ангидрида в пяти миллилитрах NMP в 50-миллилитровой полипропиленовой трубке. Затем добавьте в раствор один эквивалент 4-диметиламинопиридина или DMAP и 10 эквивалентов N, N-диизопропилэтиламина или DIEA. Добавьте эту смесь в смолу, и выдерживайте в течение 300 секунд при мощности 25 Вт и 75 градусах Цельсия.

После промывки смолы NMP промойте ее семью миллилитрами DMF в течение 120 секунд при комнатной температуре. На этом этапе переложите смолу в полипропиленовый картридж, оснащенный пробкой крышки и запорным краном. После того, как смола была промыта DCM, добавьте от 15 до 25 миллилитров смеси 1% трифторуксусной кислоты, 5% триизопропилсилана и 94% DCM в полипропиленовый картридж на 1 грамм смолы.

Поместите полипропиленовый картридж на шейкер и встряхивайте в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого слейте раствор из полипропиленового картриджа, подав вакуум. Повторив предыдущие действия три раза, промойте смолу семью миллилитрами DCM в течение 120 секунд при комнатной температуре.

Эти шаги очень важны, так как было обнаружено, что тритиловые защитные группы в нескольких смолах частично расщепляются в растворах DCM-трифторуксусной кислоты. Удаление метилтритиловых групп — медленный процесс, требующий нескольких промывок. В полипропиленовой трубке объемом 50 миллилитров растворите пять эквивалентов бензотриазола-1-ли-окси-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфата в пяти миллилитрах дибромметана.

Затем добавьте в раствор 10 эквивалентов DIEA. Добавьте смесь в смолу, промытую DCM, и выдерживайте в течение 300 секунд при мощности 25 Вт и 75 градусах Цельсия. После этого промойте смолу семью миллилитрами DCM в течение 120 секунд при комнатной температуре.

После двух стирок DCM переложите смолу в полипропиленовый картридж и дважды промойте диэтиловым эфиром. Высушите смолу в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре не менее трех часов над гидроксидом калия. Далее добавьте 10 миллилитров предварительно охлажденного коктейля из трифторуксусной кислоты в каждый грамм смолы.

Поместите полипропиленовый картридж на шейкер и встряхивайте в течение 3 часов при комнатной температуре. После этого соберите раствор для расщепления, отфильтровав смолу в полипропиленовую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте в тюбик 35 миллилитров холодного диэтилового эфира.

Центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 1, 207 раз g при четырех градусах Цельсия. Затем сцедите слой эфира. Для теста Кайзера приготовьте раствор А, растворив 16,5 миллиграммов цианистого калия в 25 миллилитрах дистиллированной воды.

Разведите один миллилитр раствора с 49 миллилитрами перидина. Далее приготовьте раствор В, растворив один грамм нингидрина в 20 миллилитрах этанола. Приготовьте раствор С, растворив 40 грамм фенола в 20 миллилитрах этанола.

После того как растворы будут приготовлены, переложите несколько шариков из смолы в пробирку. Добавьте по три капли каждого раствора в тюбик, и перемешайте. Наконец, нагрейте пробирку на нагревательном блоке до 110 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Синтез основных циклических пептидов проводили с помощью автоматизированного СВЧ-синтезатора на твердой основе по протоколу FMOC, t-бутила. Продукт был проанализирован методом масс-спектрометрии, а степень его чистоты определена с помощью ВЭЖХ. Биологический скрининг показал, что пептид pL1 был активен против Leishmania donovani, паразита, вызывающего висцеральный лейшманиоз, наиболее тяжелый лейшманиоз у людей.

Пептид pL1 снижал жизнеспособность паразитов на 75% по сравнению с контрольной обработкой. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-пять дней, если она выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в самых разных областях к изучению пептидов в качестве фармакологических регуляторов в фундаментальных исследованиях и терапии.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как разработать специализированную библиотеку пептидомиметиков с конформационным разнообразием, чтобы целенаправленно нацеливаться на белок-белковые взаимодействия. Не забывайте, что работа с трифторуксусной кислотой может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков, лабораторного халата и перчаток при работе в хорошо проветриваемом капюшоне.