Эффективный метод синтеза Пептоиды с мономерами смешанного типа Лизин / аргинин-типа и оценки их Анти-leishmanial деятельности

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы ввести мономера лизинового и аргининового ряда в одну и ту же пептоидную последовательность и оценить активность этих соединений против Leishmania mexicana, возбудителей забытого тропического заболевания кожного лейшманиоза. Для лечения кожного лейшманиоза срочно необходимы новые методы лечения, и эта процедура может помочь идентифицировать и разработать пептоиды в качестве нового класса потенциальных противоинфекционных средств для этой забытой тропической болезни. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что можно синтезировать пептоиды, содержащие смешанную катионную функциональность.

Это очень желательно, так как может помочь модулировать биологическую активность последовательностей. Несмотря на то, что это тест против млекопитающей формы паразита, его также можно использовать против стадии насекомых Leishmania mexicana или применять к клеточным линиям млекопитающих. Визуальная демонстрация этого метода действительно полезна, потому что она показывает ступенчатую природу синтеза, а также культуру паразитов на различных этапах жизненного цикла Leishmania mexicana.

Для начала этой процедуры готовят растворы в диметилформамиде так, как указано в текстовом протоколе. Затем добавьте 0,1 миллимоля амидной смолы, защищенной Fmoc, в закрытый 20-миллилитровый полипропиленовый реакционный сосуд с двумя фритами. Добавьте пять миллилитров диметилформамида и дайте сосуду постоять 60 минут при комнатной температуре.

Затем слейте воду из ДМФА с помощью твердофазной вакуумной платформы для экстракции. Далее добавляют два миллилитра приготовленного раствора пиперидина. Поместите сосуд на платформу для шейкера при 450 об/мин при комнатной температуре и встряхивайте в течение пяти минут.

Слейте раствор с помощью вакуумной станции. Затем добавьте два миллилитра раствора пиперидина и взбалтывайте при тех же условиях в течение 15 минут. После завершения встряхивания слейте раствор через вакуумную станцию.

Добавьте два миллилитра ДМФА и перемешивайте в течение 30 секунд, чтобы промыть смолу. Слейте воду из ДМФА и повторите промывку три раза. Чтобы начать синтез субмономера, добавьте один миллилитр приготовленного раствора бромоуксусной кислоты и 0,2 миллилитра приготовленного раствора ДВС.

Встряхивайте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем слейте раствор и промойте три раза, используя каждый раз два миллилитра ДМФ. Добавьте один миллилитр приготовленного аминового раствора.

Затем встряхните смолу в течение 60 минут при комнатной температуре. Слейте раствор и промойте смолу три раза, используя каждый раз два миллилитра ДМФ. Далее добавьте один миллилитр раствора бромоуксусной кислоты и 0,2 миллилитра раствора ДВС.

Встряхивайте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем слейте раствор и промойте три раза, используя каждый раз два миллилитра ДМФ. Чтобы ввести мономер, функционализированный гуанидином, добавьте в смолу один миллилитр незащищенного раствора диамина.

Встряхивайте в течение 60 минут при комнатной температуре. Затем слейте раствор и промойте смолу двумя миллилитрами ДМФА три раза. Добавьте 0,5 миллилитра приготовленного раствора 2-ацетилдимедона.

Встряхивайте в течение 60 минут при комнатной температуре. Затем слейте раствор и промойте смолу двумя миллилитрами ДМФА три раза. Продолжайте синтез субмономеров до тех пор, пока не будет получена желаемая последовательность.

Затем добавьте четыре миллилитра приготовленного раствора гидразина и взбалтывайте в течение трех минут при комнатной температуре. Слейте раствор и повторите три раза. Затем промойте смолу три раза, используя два миллилитра ДМФА для каждой промывки.

Добавьте DIPEA и шесть эквивалентов пиразола-1-карбоксамидина на каждый свободный амин в пептоидной последовательности. Встряхивайте в течение 60 минут при комнатной температуре. После того как встряхивание будет завершено, слейте раствор.

Промойте смолу три раза, используя два миллилитра дихлорметана для каждой промывки. Высушите смолу на воздухе в течение 10 минут и храните впрок. Пробное расщепление может быть выполнено после добавления аминов для проверки хода синтеза.

Чтобы начать окончательное расщепление, добавьте четыре миллилитра коктейля расщепления в тот же фриттированный реакционный картридж, используемый для синтеза, и покройте сосуд. Встряхивайте в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем с помощью фриттированного реакционного сосуда отфильтруйте коктейль из расщепления от смолы в колбу с круглым дном.

Выпарить коктейль спайности с помощью ротационного испарителя. Добавьте два миллилитра безводного диэтилового эфира, чтобы осадить пептоид. С помощью пипетки удалите диэтиловый эфир и выбросьте.

Затем повторите осаждение диэтилового эфира три раза. Как только осаждение завершится, растворите сырой пептоид в 10 миллилитрах подготовленного ацетонитрила и подкисленного водного раствора. Переложите в предварительно взвешенную емкость.

Затем заморозьте при температуре минус 20 градусов Цельсия и лиофилизируйте до сухого порошка, готового к очистке методом ВЭЖХ в обратной фазе. После культивирования паразитов Leishmania mexicana и трансформации в аксеническую стадию амастигота начните анализ цитотоксичности с приготовления растворов сложных исходных материалов, как указано в текстовом протоколе. Добавьте два микролитра пятимиллимолярного пептоидного раствора, контроль амфотерицина B и контроль ДМСО в верхний ряд 96-луночного планшета, как указано в текстовом протоколе.

С помощью многоканальной пипетки добавьте 48 микролитров свежей среды в верхний ряд. Добавьте 25 микролитров свежей среды во все остальные ряды. Далее проведите серийное разведение, пипетируя 25 микролитров раствора из верхнего ряда, добавив его в ряд ниже и перемешав.

Повторите разведение для всей пластины, отбросив последние 25 микролитров, отведенных пипетками из нижнего ряда. Затем перенесите культуру паразита в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируйте в течение пяти минут при 447 умноженных на изб.

Слейте старую среду и добавьте 10 миллилитров свежей среды. Далее с помощью пипетки аккуратно ресуспендируйте гранулу от паразитов в новой среде. Подсчитайте с помощью улучшенного гемоцитометра Нейбауэра и разбавьте культуру до восьми миллионов паразитов на миллилитр.

После того как культура будет разведена, добавьте в каждую лунку по 25 микролитров паразитов. Выдерживайте тарелку в течение 60 минут при температуре 32 градуса Цельсия. После завершения инкубации удалите по 40 микролитров раствора из каждой лунки.

Добавьте 90 микролитров свежей среды в каждую лунку и инкубируйте при температуре 32 градуса Цельсия в течение 24 часов. Затем добавьте в каждую лунку по 10 микролитров раствора на основе резазурина для повышения жизнеспособности клеток. Выдерживать при температуре 32 градуса Цельсия в течение четырех часов.

После завершения инкубации используйте планшетный ридер для измерения флуоресценции. Анализируйте данные, удаляя средний фон и сравнивая флуоресценцию лунок после нормализации с резекцией на контрольные элементы ДМСО. В этом исследовании два пептоида синтезируются с использованием 120 миллиграммов амидной смолы катка каждый.

Продукты очищаются с помощью обратной фазовой жидкостной хроматографии высокого давления, а фракции, соответствующие целевой массе, объединяются и получают в виде белых порошков. Здесь показано количество собранных двух пептоидов с выходом около 30% для фракций с чистотой более 90%. Чистота продукта оценивается с помощью аналитической обратнофазной ВЭЖХ и визуализируется на глубине 220 нанометров абсорбция амидного каркаса.

Оба пептоида кажутся однородными. Здесь представлены репрезентативные результаты анализов цитотоксичности против L. mexicana. Пятимиллимолярные стоковые растворы соединений изготовлены в клеточной культуре ДМСО и протестированы в трех количествах не менее двух раз, чтобы обеспечить надежность данных.

Можно видеть, что пептоид В более эффективен, чем пептоид А, в снижении процента жизнеспособных паразитов, причем оба имеют дозозависимый эффект. После просмотра этого метода у вас должно быть хорошее понимание того, как синтезировать, охарактеризовать и очистить пептоиды, которые содержат мономеры как лизинового типа, так и аргининового типа, и как использовать их в анализах цитотоксичности против Leishmania mexicana. Наш метод добавления двойной катионной функциональности в пептоиды добавляет только один дополнительный простой шаг к широко используемому субмономерному методу синтеза пептоидов.

Следуя этому методу, можно добавлять субмономеры лизинового или аргининового типа различной длины, чтобы помочь увеличить разнообразие библиотек, например, с боковыми цепями длиной от двух до шести атомов углерода. При попытке синтеза пептидов очень важно помнить о необходимости хорошо промывать смолу между этапами, чтобы предотвратить нежелательное добавление или удаление продуктов. Этот метод открывает исследователям путь к изучению биологической активности смешанных катионально функционализированных пептоидов и сравнению этой активности с теми, которые содержат исключительно мономеры лизина или аргинина.

Наконец, не забывайте, что паразиты и некоторые реагенты, используемые в этом протоколе, могут быть чрезвычайно опасными. Поэтому важно всегда использовать соответствующие средства индивидуальной защиты и работать в вытяжном шкафу или шкафу микробиологической безопасности, где это уместно.