Квартира Гора Подготовка к наблюдению и анализу эмбрионов рыбок данио образцами запятнана вся гора В месте Гибридизация

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы лучше визуализировать окрашенные неподвижные эмбрионы рыб данио в ранние моменты развития. Это достигается путем предварительного окрашивания эмбриона рыбы данио с помощью домашнего монтирования в гибридизации C two. Затем отбирается эмбрион для плоского крепления и делается центральный разрез в желтке с помощью пары тонких щипцов, затем инструменты для ресниц используются для аккуратного соскабливания и удаления оставшихся гранул желтка.

Наконец, эмбрион помещают в глицерин на предметное стекло, чтобы обеспечить соответствующую визуализацию образца. В конечном счете, плоское крепление позволяет лучше визуализировать окрашенные эмбрионы с дорсальной стороны за счет удаления желтка и позиционирования эмбриона в двумерной препарации. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как визуализация интактных эмбрионов на более ранних стадиях развития, заключается в том, что плоское крепление удаляет желточный мешок, позволяя рассмотреть весь эмбрион.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития, такие как характеристика домена почечного прегендерного поля у эмбриона. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что эта техника требует деликатного обращения с эмбрионом, а также потому, что изучение соответствующего давления, необходимого для удаления желточного мешка, может занять время. Демонстрировать эту процедуру буду я, Зои и Аманда, которые являются аспирантами в лаборатории вингеров.

После сбора, фиксации и окрашивания эмбрионов, согласно текстовому протоколу, выберите эмбрион для плоского монтажа с помощью одного X-P-B-S-T. Перенесите эмбрион в пластиковую или стеклянную чашку Петри. Затем, нанеся чашку под стереомикроскоп, с помощью тонких щипцов переверните эмбрион так, чтобы был получен боковой вид с видимыми концами головы и хвоста.

Затем используйте тонкие щипцы, чтобы удерживать эмбрион в устойчивом положении, и второй набор, чтобы сделать надрез в желтке в месте, расположенном по центру между головой и хвостом эмбриона. Затем с помощью тонких щипцов вычерпнуть желток из полости клеток дуба. Используйте один X-P-B-S-T, чтобы смыть случайный желток с эмбриона, используя одну-две капли одного XPBS.

Перенесите эмбрион на плоское предметное стекло. Перетащите эмбрион к краю буфера так, чтобы он оставался в ровном положении на фоне предметного стекла. Закрепляя эмбрион, с помощью инструмента для ресниц аккуратно соскребите брюшную поверхность, чтобы удалить гранулы желтка.

Если раствор PBST загромождается лишним желтком или начинает испаряться, добавьте одну-две свежие капли и перетащите зародыш в этот свежий буфер. После того, как желток будет удовлетворительно удален, аккуратно переложите эмбрион обратно в чашку Петри с PBST для окончательного промывания. Затем перенесите эмбрион в чашку Петри, содержащую 100% глицерин, и инкубируйте в течение пяти минут.

Чтобы закрепить эмбрион на предметном стекле, перенесите его в чистое стекло. Вставьте одну-две капли 100% глицерина и расположите его брюшной стороной желтка лицом к предметному стеколу. С помощью инструмента для наращивания ресниц перетащите эмбрион к краю глицериновой капли так, чтобы он оставался в ровном положении на фоне предметного стекла.

Если ось эмбриона изогнута, с помощью тонких щипцов аккуратно сделайте небольшие надрезы в оставшемся желтке, чтобы снять напряжение и расположить его ровно. На слайде. Положите небольшие углубления пластилина на четыре угла стеклянной крышки размером 18 на 18.

Медленно наденьте покровное стекло на эмбрион, наклоняя покровное стекло так, чтобы свести к минимуму количество пузырьков воздуха в глицерине. Наконец, добавьте дополнительную каплю 100% глицерина на боковую сторону защитного стекла, чтобы заполнить пространство между стеклом, а для устранения дрейфа используйте стерео или составной микроскоп для изображения, показанного здесь. Комбинация зондов была использована вместе с двумя цветными пожеланиями для маркировки развивающихся почечных предшественников, которые дают начало почке, и эмбрионы были плоскосмонтированы на ранних стадиях.

Таким образом, стадии клещей, почечные предшественники демаркированы в U-образной форме по экспрессии ими транскриптов PAX two A, окружающих париальную мезодерму, которая одновременно экспрессирует дельту С, показанную красным цветом. Когда дельта С была мечена совместно с C crox 20, был выявлен ростральный субдомен почечных предшественников, который экспрессирует дельта С, анализируя экспрессию PAX два a, SLC четыре A четыре, SLC 12 A три и S-M-Y-H-C один на 14. Таким образом, стадия клеща позволяет картировать весь почечный прогениторный домен с PAX 2 A и обнаружила, что подмножество клеток в ростральном субдомене экспрессирует SLC четыре А четыре.

Это не совпадало с поддоменом coddle у почечных предшественников, которые экспрессировали SLC 12 A three. На этом рисунке эмбрионы с мутациями в гене ретинальдегиддегидрогеназы два, необходимых для биосинтеза ретиноевой кислоты, или эмбрионы, обработанные ингибитором DEAB и ALD H, развились с уменьшенной или отмененной экспрессией соответственно WT one A, демонстрируя, что двухцветное желание с плоским препаратом ценно для изучения клеточных доменов в процессе органогенеза. У рыбок данио с генетическими мутациями или при химическом воздействии малых молекул после освоения эта техника может занять от 10 до 15 минут при правильном выполнении.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, где расположены границы сегментов почек. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно монтировать окрашенный эмбрион данио-рерио, чтобы лучше визуализировать нужные структуры путем удаления желтка.