Развитие In Vitro Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Общая цель этой процедуры заключается в оценке сократительной способности мезенхимальных клеток, подвергшихся in vitro воспалительному цитокин-индуцированному эпителиальному мезенхимальному переходу, или ЭМП. Эта мезенхимальная является вариацией основной функции клетки после ЭМП, вызванной воспалительными иммунными реакциями, такими как при идиопатическом легочном фиброзе или ремоделировании дыхательных путей при тяжелой астме. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она не требует специфических приспособлений и что она демонстрирует высокое содержание Демонтажа процедуры будут Хидэюки Такешима и Косуке Макита аспиранты из моей лаборатории.

Начните с промывки культуры эпителиальных клеток легких человека A-549 пятью-десятью миллилитрами PBS. Затем отделите адгезивные клетки двумя миллилерами трипсина-ЭДТА при 37 градусах Цельсия и пятью процентами углекислого газа. Через три минуты перенесите клеточную суспензию в конические пробирки, содержащие среду для культивирования клеток, и раскрутите клетки в центрифуге.

Ресуспендируйте гранулы в двух миллилерах клеточной питательной среды, оставив небольшую выдержку для подсчета. Затем высевать от 0,5 до 1 раза по 10 до 6-й клетки в десять миллилитров среды на десятисантиметровую полистереновую чашку и инкубировать клеточные культуры в течение 24 часов. Для индукции ЭМП на следующий день обработайте клетки 10 микролитрами TGF beta 1 и TNF alpha и верните планшеты в инкубатор еще на 48 часов.

На четвертый день промойте индуцированные EMT культуры пятью-десятью миллилерами pbs, а затем отделите клетки трипсином-ЭДТА, как показано только что. Далее раскрутите клеточные суспензии в DMEM с добавлением ингибитора триспсина и ресуспендируйте гранулы в 500 микролитрах пбн. Затем пересчитайте ячейки, и добавьте свежеприготовленную геллевую среду плотностью 3 раза по 10 в 5-ю лунку, аккуратно но быстро перемешивая раствор пипеткой до желирования.

Быстро, но осторожно внесите по 0,5 миллилитров клеток в каждую лунку необработанного 24-луночного планшета в аккуратных цилиндрических формах. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 15 минут. Когда гель полностью застынет, перемещайте стерилизованную лопатку по кругу вокруг внешней стороны каждого геля в одном направлении, чтобы отделить гели от пластин, не ломая.

При удалении геля будьте осторожны, чтобы не двигать шпателем вперед и назад в лунке. Затем с помощью шпателя аккуратно перенесите гели в отдельные 16-миллиметровые чашки для культуры тканей, содержащие пять миллилитров DMEM с добавлением одного процента FBS, с TGF beta 1 и TNF alpha или без них. Наконец, осторожно встряхните посуду, чтобы убедиться, что гели плавают на среде, и верните гели в инкубатор для клеточных культур.

Необработанные клетки a541 имеют булыжник и треугольную форму, характерную для эпителиальных клеток. Однако после стимуляции TGF beta 1 и TNF alpha клетки демонстрируют длинную веретенообразную форму, аналогичную той, которая наблюдается у месинхемных клеток. QRTCPR экспрессии эпителиальных и месинкемических маркеров до и после ЭМП показывает, что клетки A541, обработанные воспалительными цитокинами в течение 48 часов, демонстрируют значительно сниженную экспрессию CDH1 и значительно повышенную экспрессию VIAM и ACTA2.

Кроме того, стимуляция этими цитокинами ослабляет экспрессию Е-кадгерина, как это определено по результатам западного анализа крови, в то время как экспрессия виментина N-кадгерина и альфа-гладкомышечного актина индуцируется. В анализе на сокращение геля, через 48 часов, гели, содержащие клетки, обработанные TGF beta 1 и TNF alpha, меньше, чем контролируемые гели, содержащие клетки, обработанные PBS. Действительно, через 72 часа размер гелей, содержащих обработанные цитокинами гели, значительно уменьшается по сравнению с контролируемыми гелями, измеренными с помощью анализатора гелей.

Как было замечено, этапы сокращения геля могут быть завершены за три часа, если они выполнены правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать подтверждать, что ЭМП была успешно индуцирована, прежде чем проводить анализ на сокращение геля. После наблюдения этот метод дает возможность варьировать процесс ЭМП во время воспалительного состояния, такого как фиброз или ремоделирование легких.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как излучать клетки, обладающие ЭМП, в тип куагента и вспенивать их в среде.