Измененный мышиных эмбриональных стволовых клеток основанных Пробирной для Количественная Кардиогенный эффективность индукционной

Общей целью данного эксперимента является определение важнейшей временной регуляции, необходимой для дифференцировки кардиомиоцитов в эмбриональных стволовых клетках мыши. Это достигается путем первого формирования эмбриональных тел в 96-луночной круглой нижней пластине для стандартизации формирования EB в качестве второго этапа. Белковые или химические модуляторы добавляются в ЭБС в течение заранее определенного периода времени, что позволяет осуществлять временный контроль исследуемых путей.

Затем бьющие EBS количественно оцениваются вручную для определения индукционной эффективности различных схем модуляции сигнала. Получены результаты, показывающие временные потребности основных сигнальных путей для дифференцировки кардиомиоцитов на основе процента сформированного бьющегося ЭБС и подтверждения методом висячей капли. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как подвесные капли, заключается в том, что он стандартизирует и упрощает трудоемкую процедуру и позволяет легко считывать данные для количественной оценки.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии стволовых клеток, такие как определение необходимой сигнальной коагуляции, которая направляет дифференцировку в сторону желаемого типа клеток. Эмбриональные стволовые клетки мыши Gro в 10-сантиметровых клеточных культуральных планшетах с ЭС клеточной средой мыши с добавлением фактора ингибирования лейкемии. Когда ES-клетки находятся на 50–70% конфлюенции, они готовы к использованию.

Удалите ЭС среды и один раз промойте клетки пятью миллилитрами стерильного PBS. Добавьте два миллилитра 0,05% трипзина ЭДТА в каждую тарелку и инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Затем закалите трипы в ЭДТА с помощью трех миллилитров ЭС среды на планшет и перенесите ячейки в центрифугу объемом 50 миллилитров

Вращайтесь со скоростью 1000 вращений в минуту в течение трех минут. После центрифугирования удалите супинат и повторно суспендируйте клеточную гранулу желаемым количеством EB-среды. Подсчитайте количество клеток, а затем разбавьте ячейки до пяти умножить на 10 до трех клеток на миллилитр.

В фильтрующие среды с помощью многоканальной пипетки добавьте 100 микролитров клеток, содержащих углеродные фильтрующие фильтрующие вещества, в каждую лунку микротитровальной пластины с круглым дном и 96 лунками. Количество необходимых 96 луночных планшетов будет зависеть от количества условий и временных точек эксперимента. Поместите 96 планшетов с микротитрами с круглым дном в увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы определить критические временные окна ключевых сигнальных путей для кардиогенеза.

К ES-ячейкам добавляются модуляторы специфических сигнальных путей. В 96 круглых донных колодцев вставлен модулятор сигнализации, который разводится в среде в каждую лунку в различные моменты времени. Половина скважин в каждой 96-луночной пластине используется для каждой начальной точки времени обработки.

В разных точках остановки мы собираемся вымыть сигнальные модуляторы из каждой скважины, меняя среду, и при этом необходимо проявлять большую осторожность, чтобы предотвратить разрушение эмбриональных тел в разных временных точках остановки. Промывайте модуляторы, меняя среду ЭБ для скважин. Наклоните 96-луночный планшет примерно на 10 градусов и аккуратно удалите среду из лунки с помощью многоканальной пипетки.

Затем добавьте обратно среду EB без модулятора в каждую лунку для любой обработки дольше 48 часов. Меняйте среду EB, дополненную свежими модуляторами, каждые два дня до желаемого времени остановки. Точки через семь дней после индуцирования ЭБС путем переноса ЭС-клеток на 96-луночные планшеты исследуют сокращение БЭ под микроскопом.

Оцените скважины с контрактным EBS как положительные, чтобы получить процент заражения EBS для каждого отдельного периода лечения. Временные окна передачи сигналов для кардиогенеза, выявленные в ходе экспериментов с 96 луночными планшетами, могут быть проверены в ЭБС, изготовленном из висячих капель для создания висячих капель ЭБ. Сначала приготовьте чашки Петри, добавив три-четыре миллилитра PBS для профилактики аберрации капель, позже.

Затем суспензию ES-клеток, приготовленную с конечной плотностью 2,5 умножить на 10 к четырем клеткам на миллилитр, выливают в бактериальную чашку для легкого доступа. С помощью многоканальной пипетки добавьте 20 микролитров капель ES-клеток на перевернутые крышки чашек Петри. Не позволяйте отдельным каплям соприкасаться друг с другом.

Как правило, на одну крышку может поместиться до 80 капель. Затем заверните крышку на чашку Петри, содержащую PBS, инкубируйте в течение 48 часов в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить образование EB. Через 48 часов смойте ЭБС, образовавшуюся из свисающих капель с каждой крышки, тремя миллилитрами ЭБ-среды.

Вытащите две крышки EBS в новую чашку Петри. Инкубируйте чашку Петри в течение четырех дней в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на четвертый день, перенесите EBS в суспензии на шесть лунок, покрытых 0,2% желатином. 30 EBS передаются в каждую лунку для инкубации сигнальных модуляторов в период времени, определенный из экспериментов с 96 луночными планшетами, через семь дней после того, как были получены висячие капли.

Наблюдайте за EBS под микроскопом на предмет сокращения EB: ES-клетки, выращенные в круглых донных лунках 96-луночного планшета, образуют EBS, как показано на этом репрезентативном изображении EB, сформированного на четвертый день. Критическими временными точками для кардиогенеза ЭС являются временные окна, которые содержат наибольший процент заражающихся БЭБ, обработанных сигнальными модуляторами, по сравнению с управлением транспортным средством. Здесь показан спонтанно сокращающийся очаг кардиомиоцитов, образованный из обработанных дорсальным морфином ES-клеток на 10-й день дифференцировки на 96-луночной микротитровой пластине.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как эффективно определять критическую временную регуляцию, окна ключевых сигнальных путей в кардиогенезе ЭС.