Электрофизиологические Способ записи ответов внутриклеточный амперных Drosophila Фоторецепторов и Интернейроны к световой раздражитель В Vivo

Общая цель этой процедуры заключается в регистрации внутриклеточных электрических реакций фоторецепторов и зрительных интернейронов дрозофилы на контролируемые световые стимулы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейрокодирования, например, как световой стимул будет кодировать его в одну из своих реакций или как его визуальная информация, фоторецепторы и интернейроны извлекаются из световых стимулов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает долгосрочные, высококачественные записи из исследования с небольшим ущербом для внутриклеточной среды и информационной выборки.

Особенность демонстрации, на которую это может повлиять, имеет решающее значение, так как ее различные шаги сложно научиться правильно выполнять, не видя их. Вытяните микроэлектрод сравнения из боросиликата накаливания или из трубки из кварцевого стекла с помощью стандартного съемника для дозатора. Старайтесь добиться короткого, постепенного сужения.

Точные настройки зависят от прибора. Размер пор на кончике не имеет решающего значения, потому что для экспериментов он будет нарушен. Затем вытяните записывающий электрод из той же стеклянной трубки и попытайтесь добиться тонкого постепенного сужения длиной от 10 до 15 миллиметров.

В световом микроскопе установите электрод на стеклянную сторону с помощью нескольких клеев и используйте 40-кратный воздушный объектив для осмотра его наконечника. Хороший электрод плавно сужается к незаметно маленькому наконечнику, вокруг которого можно увидеть непрерывные параллельные более темные и более светлые интерференционные узоры. Непосредственно перед экспериментом заполните электрод сравнения кольцами от мух с помощью пятимиллилитрового шприца, подключенного к фильтру частиц, с тонким пластиковым наконечником.

Для экспериментов с фоторецепторами нагрузите записывающий электрод 3 молярами хлорида калия до тех пор, пока на его большом конце не образуется капля. Это сведет к минимуму шум от жидкостного перехода во время записи. Для работы с гистаминергическими БМК заполняйте записывающие электроды 3 молярами ацетата калия, 0,5 миллимоляра хлорида калия, чтобы свести к минимуму воздействие на хлоридную батарею ячейки.

Начните с загрузки свежей флакона мух возрастом от пяти до 10 дней. Молодые мухи более хрупкие, но могут быть зарегистрированы от. Выберите первую муху для электрофизиологии.

С крупными самками работать проще всего. Находясь в улавливающей трубке, воспользуйтесь присущей им склонностью подниматься вверх в наконечник пипетки и закрывать меньший наконечник. Затем подсоедините шприц объемом 100 миллилитров с помощью гибкого пластикового шланга к наконечнику пипетки, который увеличен только для того, чтобы пропустить дрозофилу, а другой конец соедините с большим наконечником пипетки, прикрепленным к держателю для мухи.

Затем выдавите небольшой объем воздуха из шприца, чтобы вытолкнуть муху в держатель мух. Посмотрите в стереомикроскоп и осторожно подайте больше воздуха, пока голова мухи не начнет выступать из конического конца держателя для мух. Убедитесь, что муха прочно зажата своей грудной клеткой.

Затем закрепите муху пчелиным воском. Используйте самую низкую температуру нагревателя воска, чтобы чисто расплавить воск, который будет казаться прозрачным. Если будет слишком жарко, воск сгорит.

Обездвижите голову мухи, нанеся немного пчелиного воска на хоботок и уголок правого глаза, избегая роговицы. Закрепите эти две точки на держателе для мух. Завершите этот шаг быстро, чтобы не обжечь муху.

Далее наденьте защитные очки и изготовьте микронож. Зажмите лезвие бритвы из нержавеющей стали двумя держателями лезвий с плоской рукояткой и разрежьте небольшую полоску его острого края. В идеале изготовьте острый, как бритва, край, напоминающий шпиль.

Теперь, осторожно и с большим вниманием к деталям, используйте микронож, чтобы открыть несколько омматидий левого глаза мухи, например, на четыре-пять омматидий от тыльной кутикулы прямо над экватором глаза. Это обеспечит проход для записывающего микроэлектрода. Это довольно сложная задача, требует хорошо сделанного ножа, и этому нужно учиться с практикой.

Затем аккуратно удалите небольшой кусочек роговицы из отверстия, обнажив сетчатку под ним. Теперь с помощью тонких волосков вазелинового аппликатора быстро закройте отверстие крошечным каплей вазелина. Желе имеет дополнительное преимущество, заключающееся в уменьшении внутренней емкости пипетки.

Избегайте размазывания глаза, так как это размывает оптику. При работе с микроэлектродным усилителем всегда заземляйте, прикасаясь к металлической поверхности клетки Фарадея или антивибрационного стола для предотвращения статических зарядов. Закрепите установленную ширинку на столбе платформы для подготовки мух.

Поверните держатель мухи так, чтобы левый глаз мухи был обращен прямо к исследователю. Затем с помощью небольшого микроманипулятора аккуратно вставьте тупой электрод сравнения через глазки мухи в капсулу головы. Убедитесь, что муха все еще выглядит здоровой и двигает своими усиками.

Подготовка должна быть превосходной, чтобы заслуживать записи. Теперь введите острый записывающий микроэлектрод в левый глаз через отверстие, покрытое желеобразным покрытием. Когда он попадает в ткань, расположение кончика электрода должно быть видно по его отражательной способности.

Хрупкий кончик электрода должен быть идеально направлен, иначе он сломается, что очень сложно. В зависимости от типа регистрируемой клетки, голова мухи должна быть ориентирована немного по-разному. Установив электроды на место, включите микроэлектродный усилитель.

Затем выключите источник холодного света, отключите его от сети и подключите к центральному заземлению, чтобы свести к минимуму электрический шум, вызванный контуром заземления. Затем отрегулируйте световоды на гусиной шее так, чтобы система рычагов Carden могла свободно перемещаться вокруг ширинки. Затем выключите свет в комнате, чтобы поместить подготовку к мухе в относительную темноту.

Теперь измерьте сопротивление записывающего электрода в глазу. Она должна быть в диапазоне от 100 до 260 мегаом. Иногда наконечник блокируется и может быть очищен с помощью функций емкостного жужжания и импульсов тока.

Если это не помогло, используйте новый электрод. Далее установите усилитель на токовый клещи или мост и обнулите напряжение между электродами. После того, как муха приспособится к темноте в течение нескольких минут, введите наконечник записывающего электрода в глаз с шагом от 0,1 до одного микрона с помощью пьезостеппера или с помощью мягкого вращения ручки с тонким разрешением.

На каждом шаге стимулируйте глаз световой вспышкой от одной до 10 миллисекунд. Каждая световая вспышка вызовет кратковременное падение напряжения или ЭРГ. Когда наконечник электрода входит в пластинку, замыкаясь на БМК, ЭРГ изворачивается.

Затем приступайте к снятию мерок. Благодаря неинвазивности, сигнальные характеристики отдельных клеток могут быть изучены в их близком к естественному состоянии. Реакция напряжения фоторецептора R1-R6 на тусклый и яркий свет была измерена при 20 градусах Цельсия.

Затем фоторецептор R1-R6 сравнивали с БМО при температуре 25 градусов Цельсия. Каждый из них был измерен на разных мухах, так как внутриклеточные записи с помощью двух острых микроэлектродов у одной и той же мухи слишком сложны, чтобы быть жизнеспособными. Повторяемость ответов становится очевидной, когда данные накладываются друг

Отношение сигнал/шум в частотной области было получено путем четырехлетнего преобразования фрагментов данных о сигнале и шуме в спектр мощности, а затем деления среднего спектра мощности сигнала на соответствующий спектр средней мощности шума. Результат может быть чрезвычайно чувствительным к сигналам при наилучшей подготовке. Этот метод может быть использован для регистрации многих видов.

Мухам Coenocia давали такую же натуралистическую, повторяющуюся световую стимуляцию при температуре 19 градусов по Цельсию. Данные были получены до и после синаптики от одной и той же мухи путем продвижения записывающего электрода. Более быстрая динамика регистрации согласуется с хищнической природой этого вида.

После мастеринга эта техника позволяет всегда делать длинные записи высокого качества, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно понимать, что это похоже на обучение игре на пианино. Чем больше вы практикуетесь, тем лучшие результаты вы получите.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как фармакологические вмешательства, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как роль нейромодуляторов в формировании реакций. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиофизики к изучению способов оптимизации световой информации, захвата и передачи, а также едких биохимических реакций в механизмах фототрансдукции и в следующих биологических науках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить дрозофилу к внутриклеточным экспериментам и как пробудить нейронные реакции от ее фоторецепторов и интернейронов.