Легкий способ для растений полисом профилирование

Привет, меня зовут Сесиль. Я работаю в LGBP в Марселе. Протокол, который мы собираемся описать в этом видео, представляет собой простой метод выделения полисом и моносом из различных растительных тканей с целью идентификации активно транслируемых мРНК и изучения регуляции трансляции.

В качестве примера мы покажем вам выделение полисом из шестидневных сеянцев Arabidopsis thaliana, последующее выделение РНК и анализ полученных результатов. Посейте семена на тарелку и оставьте их на двое суток при четырех градусах. Затем выращивайте растения в течение шести дней.

Соберите рассаду и измельчите ее в жидком азоте. Взвесьте 300 миллиграмм растительного порошка и добавьте 2,4 миллилитра полисомного буфера. Центрифуга для сбора фрагментов растений и загрузки надосадочной жидкости на вершину градиента сахарозы.

Ультрацентрифужный градиент затем собирает его снизу вверх с непрерывным считыванием внешнего диаметра. Втяните фракцию в полисому, моносому и надосадочную фракцию и осадите РНК на ночь. Ультрацентрифугу, ресуспендировать гранулу и извлечь РНК для последующего анализа. За несколько дней до выполнения полисомного профилирования подготовьте градиент сахарозы.

Приготовьте 50, 35 и 20% раствор сахарозы и держите их при четырех градусах. Залить 50%-ным слоем сахарозы. Заморозьте его в морозилке минус 40

Через шесть часов добавьте слой 35% и заморозьте его в морозильной камере минус 40 на ночь. Высыпаем первый 20%-ный слой и замораживаем его. В день эксперимента достаньте из морозилки необходимое количество градиентов.

Добавьте последние 20% слоя сахарозы и дайте градиентам оттаять в холодном помещении. Подготавливаем образец только что собранного растения. Здесь мы используем шестидневную рассаду Arabidopsis thaliana.

Соберите жидкий азот из замороженных растений и тщательно измельчите их. Вес 300 миллиграмм растительного порошка. Быстро добавьте 2,4 миллилитра свежего полисомного буфера и гомогенизируйте.

Нанесите раствор пипеткой в две пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте цитозольный экстракт. Пипеткой надосадочная жидкость.

Будьте осторожны, чтобы не допустить попадания фрагментов растения. Они испортили бы профиль на следующем этапе. Загрузите надосадочную жидкость на градиент сахарозы, не нарушая градиент.

Поместите градиент в ведро с ротором SW 41. Центрифуга. Чтобы визуализировать профиль полисом и собрать фракцию, мы используем простую систему, состоящую из капиллярной трубки, которая погружается в градиент. Он связан с УФ-кюветой.

Он подключается к перистальтическому насосу. УФ-спектрофотометр непрерывно регистрирует внешний диаметр по мере прохождения градиента через кювету. Сборник фракций позволяет собирать две миллилитровые фракции.

Очистите кювету и поместите ее в спектрофотометр. Снимите градиент с ведра, не нарушая его. Хлорофиллы должны быть сосредоточены на вершине градиента.

Погрузите капиллярные трубки в нижнюю часть градиента. Запустите перистальтическую помпу. Градиент собирается снизу вверх, и OD непрерывно считывается.

Собирается две миллилитровые фракции. Здесь представлена форма классического профиля. Осаждение РНК осуществляется с помощью гидрохлорида гуанидиния и изопропанола.

Сначала налейте один объем гидрохлорида гуанидиния в 50-миллилитровую трубку, а затем добавьте фракцию. Затем добавьте 1,5 объема изопропанола и 50 мкг равного курьера. Осадите РНК на ночь при температуре минус 20 градусов.

Переложите фракции в ультрацентрифужные пробирки объемом 40 миллилитров и сбалансируйте пробирку изопропанолом. Центрифуга. Удалите надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах теплого TE буфера.

Далее экстрагируйте РНК путем проведения классической экстракции фенолхлороформа. Здесь показан репрезентативный профиль экстракта полисом из шестидневного сеянца арабидопсиса. Основной пик соответствует моносоме, мРНК, которые связаны с одной рибосомой.

Первая часть профиля соответствует полисомальным фракциям, а именно мРНК, связанной со многими рибосомами. Каждый пик соответствовал ассоциации новой рибосомы с мРНК. Последняя часть профиля соответствует так называемой надсадочной фракции, которая содержит свободные рибосомные субъединицы и РНК.

Большое количество субъединицы 60S образует плечо рядом с пиком моносомы. Чтобы оценить их целостность, РНК, извлеченные из фракций, можно запустить на классическом арагозном геле, прежде чем использовать для дальнейших экспериментов. Мы использовали этот протокол для выделения полисом из проростков Arabidopsis thaliana, а также из молодых и старых розеток, а также из листьев Nicotiana benthamiana, томатов и риса, поэтому он должен работать с широким спектром растений и тканей.

Очищенные РНК совместимы с микроматричным анализом, а также для идентификации малых РНК, связанных с полисомальными фракциями.