Легкий способ для растений полисом профилирование

Здравствуйте, меня зовут Сесиль. Я работаю в LGBP в Марселе. В этом видео мы опишем простой метод выделения полисом и моносом из различных тканей растений для идентификации активно транслируемых мРНК и изучения регуляции трансляции.

В качестве примера мы продемонстрируем изоляцию полисом из шестидневных проростков Arabidopsis thaliana, последующее выделение РНК и анализ полученных результатов. Высейте семена на чашку Петри и выдержите их два дня при температуре 4 °C. Затем выращивайте растения в течение шести дней.

Соберите проростки и измельчите их в жидком азоте. Взвесьте 300 mg растительного порошка и добавьте 2,4 mL полисомного буфера. Центрифугируйте пробу для осаждения фрагментов растений и нанесите супернатант на верхний слой сахарозного градиента.

Проведите ультрацентрифугирование в градиенте, затем собирайте фракции снизу вверх с непрерывным измерением оптической плотности (OD). Разделите фракции на полисомную, моносомную и супернатантную, после чего осадите РНК в течение ночи. Проведите ультрацентрифугирование, ресуспендируйте осадок и экстрагируйте РНК для последующего анализа. За несколько дней до проведения полисомного профилирования подготовьте сахарозный градиент.

Приготовьте растворы сахарозы с концентрацией 50%, 35% и 20% и храните их при температуре четырех градусов. Налейте слой 50% сахарозы. Заморозьте его в морозильнике при температуре минус 40.

Через шесть часов добавьте слой 35% и заморозьте его в морозильной камере при температуре -40 °C на ночь. Налейте первый слой 20% и заморозьте его. В день проведения эксперимента извлеките из морозильной камеры необходимое количество градиентов.

Добавьте последний слой 20% сахарозы и дайте градиентам разморозиться в холодильной комнате. Подготовьте образец из свежесобранного растения. В данном случае используются шестидневные проростки Arabidopsis thaliana.

Соберите растения, замороженные в жидком азоте, и тщательно измельчите их. Взвесьте 300 mg растительного порошка. Быстро добавьте 2.4 mL свежего полисомного буфера и гомогенизируйте.

Перенесите раствор в две пробирки по 1,5 мл. Центрифугируйте цитозольный экстракт. Соберите супернатант с помощью пипетки.

Следите за тем, чтобы в образец не попали фрагменты растений, так как они исказят профиль на следующем этапе. Нанесите супернатант на градиент сахарозы, стараясь не нарушить структуру градиента.

Поместите градиент в чашку ротора SW 41. Центрифугируйте. Для визуализации профиля полисом и сбора фракций используется простая система, состоящая из капиллярной трубки, погруженной в градиент. Она соединена с УФ-кюветой.

Система подключена к перистальтическому насосу. УФ-спектрофотометр непрерывно регистрирует значение OD по мере прохождения градиента через кювету. С помощью фракционного сборника осуществляется сбор фракций объемом по два миллилитра.

Очистите кювету и поместите ее в спектрофотометр. Аккуратно извлеките градиент из стакана, не нарушая его структуру. Хлорофиллы должны быть сконцентрированы в верхней части градиента.

Опустите капиллярные трубки до дна градиента. Запустите перистальтический насос. Градиент собирается снизу вверх, при этом непрерывно измеряется OD.

Собирают фракции объемом по два миллилитра. Здесь представлен вид классического профиля. Осаждение РНК проводят с использованием гуанидингидрохлорида и изопропанола.

Сначала налейте один объем гуанидина гидрохлорида в пробирку объемом 50 миллилитров, после чего добавьте фракцию. Затем добавьте 1,5 объема изопропанола и 50 microgram равного количества носителя. Осадите РНК в течение ночи при температуре минус 20 градусов.

Перенесите фракции в 40-миллилитровые ультрацентрифужные пробирки и уравновесьте пробирку изопропанолом. Центрифугируйте. Удалите супернатант и высушите осадок на воздухе. Ресуспендируйте осадок в 200 микrolитрах теплого ТЕ-буфера.

Далее проведите выделение РНК методом классической фенол-хлороформной экстракции. Здесь представлен типичный профиль экстракта полисом из шестидневного проростка Arabidopsis. Основной пик соответствует моносоме — мРНК, связанной с одной рибосомой.

Первая часть профиля соответствует полисомальным фракциям, а именно мРНК, связанным с множеством рибосом. Каждый пик соответствует присоединению новой рибосомы к мРНК. Последняя часть профиля соответствует так называемой супернатной фракции, которая содержит свободные рибосомные субъединицы и РНК.

Большое количество субъединиц 60S образуют «плечо» рядом с пиком моносом. Чтобы оценить их целостность, РНК, экстрагированные из фракций, можно нанести на классический агарозный гель перед использованием в дальнейших экспериментах. Мы использовали данный протокол для выделения полисом из проростков Arabidopsis thaliana, а также из молодых и старых розеток, в том числе из листьев Nicotiana benthamiana, томата и риса, поэтому он должен работать с широким спектром растений и тканей.

Очищенные РНК совместимы с микрочиповым анализом, а также пригодны для идентификации малых РНК, ассоциированных с полисомальными фракциями.