Воссоздание Basic митотических веретен в сферических эмульсионных каплях

Общая цель данной процедуры заключается в реконструкции структур, подобных веретену деления, в условиях геометрического ограничения внутри капель эмульсии «вода в масле». Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области сборки веретена деления, такие как: каким образом позиционируются и собираются веретена, и каков конкретный вклад отдельных компонентов в эти процессы? Основным преимуществом данного метода является использование подхода «снизу вверх» для воссоздания веретеноподобных структур в условиях геометрического ограничения, имитирующего форму клетки в состоянии митоза.

Этот метод также может быть использован для изучения других процессов, зависящих от клеточного ограничения. Смешайте 10 частей преполимера PDMS с одной частью отвердителя, чтобы общая масса составила около 40 граммов. Затем поместите смесь в вакуумную камеру примерно на 30 минут для удаления пузырьков воздуха.

Тем временем оберните форму алюминиевой фольгой, чтобы создать чашу глубиной 1 см и диаметром 4 дюйма. Когда форма будет готова, налейте в нее примерно 3/4 смеси PDMS. Затем снова поместите PDMS в вакуумную камеру еще на 30 минут.

После дегазации подвергните PDMS отверждению в течение одного часа при 100 °C. Тем временем подготовьте предметные стекла для центрифугирования, очистив их от пыли с помощью сжатого воздуха. Затем нанесите оставшуюся смесь PDMS на стекла методом центрифугирования.

Прокаливайте эти предметные стекла в течение одного часа при 100 °C для отверждения PDMS. Затем осторожно снимите PDMS с помощью лезвия бритвы и просеките в полосках PDMS необходимые отверстия для изготовления микрофлюидных чипов. Теперь обработайте микрофлюидный чип и стекло с покрытием из PDMS коронным разрядом в течение нескольких секунд.

Наконец, поместите микрофлюидный чип на каждый предметное стекло каналами вниз и выдерживайте чипы в печи в течение ночи при 100 °C. Сначала, используя стеклянную посуду, промытую хлороформом, приготовьте около 250 µg липидов, растворенных в хлороформе. Осторожно высушите липидную смесь инертным газом.

Затем поместите образец в вакуумную камеру на один час. После этого растворите липиды в минеральном масле и 2,5% сурфактанте до концентрации 0,5 mg/mL, что составляет примерно 500 µL. Для полного растворения липидов подвергните смесь воздействию ультразвука в течение 30 минут при частоте 40 kHz.

Затем нанесите PDMS на покровные стекла методом центрифугирования, чтобы толщина слоя соответствовала параметрам объектива микроскопа. После этого нанесите PDMS на предметные стекла тем же методом. Теперь отверждайте покрытые PDMS покровные и предметные стекла в течение одного часа при 100 °C.

Затем создайте проточные кюветы, плотно расположив тонкие полоски лабораторной герметизирующей пленки на стеклянных предметных стеклах, покрытых PDMS. Разместите полоски шириной 3 мм с интервалом примерно 2 мм между ними. Затем накройте проточные кюветы покровным стеклом, покрытым PDMS, и загерметизируйте сборку, расплавив пленку при 100 °C в течение одной минуты.

После нагрева осторожно прижмите покровное стекло и загерметизируйте его с помощью Valap. Затем подготовьте чашку из PDMS для длительной визуализации. Пробейте отверстие диаметром 4 мм в срезе PDMS толщиной 3 мм.

Затем подвергните воздействию коронного разряда срез PDMS и покровное стекло с покрытием из PDMS. После обработки поместите их один на другой и выдерживайте полученную конструкцию в печи в течение ночи при температуре 100 °C. Контролируйте образование капель с помощью инвертированного микроскопа в режиме светлого поля.

Подсоедините липидную масляную фазу к контроллеру давления и повышайте давление до тех пор, пока капля масла не выйдет из трубки пика. Подсоедините трубку пика ко второму входному отверстию микрофлюидного чипа. Затем полностью заполните микрофлюидные чипы липидной масляной фазой через второе входное отверстие.

Затем подайте водную фазу на основе MRB-80 через первый вход. Регулируйте размер капель, изменяя давление липидной масляной фазы и водной фазы, чтобы создать капли диаметром около 15 мкм. В качестве отправной точки рекомендуется установить давление около 800 мбар для липидной масляной фазы и 200 мбар для водной фазы.

После достижения желаемого размера капель полностью заполните проточную кювету каплями. Эти капли формируются с использованием малых объемов водной фазы. Это означает, что микрофлюидная установка должна работать быстро, чтобы не израсходовать всю водную фазу до того, как будут сформированы капли нужного размера.

После заполнения осторожно закройте концы проточной кюветы с помощью Valap. Если капли продолжают двигаться, значит, герметизация неполная или в систему попали пузырьки воздуха. Для длительной визуализации перенесите капли в чашку из PDMS и покройте слоем липидно-масляной смеси.

Разморозьте центросомы при комнатной температуре, затем выдержите их при 37 °C в течение 20 минут для обеспечения надлежащей нуклеации микротрубочек. Пока центросомы выдерживаются, приготовьте на льду смесь для анализа. Она должна содержать тубулин, GTP, систему поглощения кислорода, молекулярные генераторы силы, такие как сшиватели микротрубочек, ATP и систему регенерации ATP.

После перемешивания центрифугируйте образец в охлажденном роторе Airfuge при давлении 30 psi в течение трех минут. Затем добавьте к смеси предварительно нагретые центросомы. Оптимизируйте количество добавляемых центросом, чтобы в каждой капле оказывалось одна или две центросомы.

Затем используйте данную смесь для получения эмульсионных капель по ранее описанному методу. Чтобы привлечь динеин к биотинилированным липидам на поверхности капли, добавьте GFP-dynein TMR и стрептавидин в водную фазу. С помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском визуализируйте рост микротрубочек после 30 минут при 26 °C.

Во время визуализации рост микротрубочек можно стимулировать, повысив температуру до 28 или даже 30 °C. Для Z-проекций снимайте стеки с интервалом в 1 мкм, что потребует примерно 20 изображений на одну каплю. Перейдите на основную панель управления камерой, нажмите «Edit Z» и установите значение «Z Step» на 1.0.

Нажмите «Next», чтобы сохранить настройки. Затем установите максимальное линейное усиление EM (EM Gain), перейдя на вкладку «Camera» в панели «Acquisition» и переместив ползунок EM Gain на значение 300. После этого в той же вкладке установите время экспозиции (Exposure Time) на 200 milliseconds.

Нажмите «Record», чтобы сохранить настройки. Для экспериментов по визуализации живых объектов выполняйте Z-проекции каждые две минуты в течение двух часов, сократив время экспозиции примерно до 100 миллисекунд и увеличив Z-интервалы до двух микрон. Для экспериментов по визуализации живых объектов используйте чашку из PDMS вместо обычной проточной кюветы для обеспечения максимальной иммобилизации образца.

С использованием описанных протоколов изучалось формирование астеров в каплях эмульсии вода-в-масле, содержащих центросомы. Первоначально центросомы свободно диффундируют в ограниченных объемах. Примерно через 20–30 минут становятся заметны первые микротрубочки, и диффузия центросом ограничивается по мере того, как микротрубочки растут во всех направлениях в сторону кортекса.

Когда микротрубочки становятся длиннее половины диаметра капли, центросомы вытесняются к противоположным границам, при этом микротрубочки растут вдоль кортекса капли. В отсутствие стрептавидина динеин равномерно распределен по всей капле. Однако при добавлении стрептавидина примерно через 10 минут после формирования капли динеин связывается с биотинилированными липидами.

При наблюдении за флуоресцентным тубулином в присутствии кортикального динеина становится очевидно, что центросомы расположены центрально. В то же время при отсутствии динеина центросомы смещаются к противоположным сторонам капли. Вероятно, это связано с тем, что динеин способствует катастрофам микротрубочек и создает кортикальные тянущие силы, что приводит к центрированию астеров.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать микрофлюидные технологии для создания веретенообразных структур в сферических эмульсионных каплях. После освоения метода процесс формирования и визуализации капель занимает от двух до трех часов при правильном выполнении. Используя данную процедуру, можно инкапсулировать другие факторы сборки веретена для изучения их влияния на морфологию и позиционирование веретена.

При использовании хлороформа или PDMS следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток.