Воссоздание Basic митотических веретен в сферических эмульсионных каплях

Общая цель этой процедуры заключается в воссоздании митотических веретенообразных структур в геометрическом удержании воды в каплях масляной эмульсии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сборки митотических шпинделей, например, как позиционируются и собираются шпиндели, и каков конкретный вклад отдельных компонентов в эти процессы? Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы используем подход «снизу вверх» для воссоздания веретенообразных структур в геометрической конфайнменте, имитирующей форму митотической ячейки.

Этот метод также может быть использован для изучения других процессов, которые зависят от клеточного удержания. Смешайте 10 частей предварительного полимера PDMS с одной частью отвердителя общей массой около 40 граммов. Затем поместите смесь в вакуумную камеру примерно на 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Тем временем оберните форму алюминиевой фольгой, чтобы получилась чашка глубиной один сантиметр и диаметром четыре дюйма. Когда все будет готово, вылейте в форму примерно 3/4 смеси PDMS. Затем верните PDMS в вакуумную камеру еще на 30 минут.

После дегазации отверждайте PDMS в течение часа при температуре 100 градусов Цельсия. Тем временем подготовьте несколько стекол для нанесения отжима, смахнув с них пыль сжатым воздухом. Затем нанесите остатки смеси PDMS на предметные стекла.

Отверждите эти предметные стекла в течение часа при 100 градусах Цельсия, чтобы затвердеть PDMS. Затем аккуратно снимите PDMS с помощью лезвия бритвы и проделайте необходимые отверстия из полосок PDMS, чтобы получить микрофлюидные чипы. Теперь коронный разряд обрабатывает микрофлюидный чип и предметное стекло с покрытием PDMS в течение нескольких секунд.

Наконец, поместите микрофлюидный чип на каждое стекло каналами вниз и запекайте чипсы в течение ночи при температуре 100 градусов Цельсия. Во-первых, используя стеклянную посуду, вымытую хлороформом, приготовьте около 250 микрограммов растворенных в хлороформе липидов. Тщательно высушите липидную смесь инертным газом.

А затем поместить его в вакуумную камеру на час. Затем растворите липиды в минеральном масле и 2,5% поверхностно-активного вещества до 0,5 миллиграмм на миллилитр, что составляет около 500 микролитров. Чтобы полностью растворить липиды, обрабатывайте смесь ультразвуком в течение 30 минут при 40 килогерц.

слой PDMS на защитные стекла толщиной в размер, соответствующий объективу микроскопа. Затем нанесите слой PDMS на предметные стекла. Теперь отверждите защитные стекла и предметные стекла с покрытием PDMS в течение часа при температуре 100 градусов Цельсия.

Затем изготовьте проточные ячейки, плотно расположив тонкие ломтики лабораторной герметизирующей пленки на стеклянных предметных стеклах с покрытием PDMS. Расположите три миллиметровые полоски на расстоянии примерно двух миллиметров друг от друга. Затем накройте проточные ячейки защитным накладкой с покрытием PDMS и запечатайте сборку, расплавив пленку при температуре 100 градусов Цельсия в течение минуты.

После нагрева аккуратно нажмите на крышку и закройте ее Valap. Затем подготовьте чашку PDMS для долгосрочной визуализации. Пробейте отверстие диаметром четыре миллиметра в ломтике PDMS толщиной три миллиметра.

Затем коронным разрезом обрабатывают срез PDMS и наносят покровное стекло с покрытием PDMS. После обработки расположите их друг над другом и запекайте сборку в течение ночи при температуре 100 градусов Цельсия. Следите за образованием капель на инвертированном светлопольном микроскопе.

Подсоедините липидную масляную фазу к регулятору давления и увеличивайте давление до тех пор, пока капля масла не выйдет из пиковой трубки. Подсоедините пиковую трубку к входу двух микрофлюидных чипов. Затем полностью заполните микрофлюидную стружку липидной масляной фазой со второго входа.

Далее вводим водную фазу на основе МРБ-80 с первого входа. Контролируйте размер капель, изменяя давление липидной масляной фазы и водной фазы для создания капель диаметром около 15 микрон. Около 800 миллибар для липидной масляной фазы и 200 миллибар для водной фазы является хорошей отправной точкой.

После получения нужного размера капель полностью заполните проточную ячейку каплями. Эти капли образуются с использованием небольших объемов водной фазы. Это означает, что микрофлюидная установка должна работать быстро, чтобы не потерять всю водную фазу до того, как образуются капли нужного размера.

После заполнения осторожно закройте концы проточной ячейки с помощью Valap. Если капли не перестают двигаться, значит, уплотнение не завершено или в него могли попасть пузырьки воздуха. Для долговременной визуализации переложите капли в чашку PDMS и накройте слоем масляной липидной смеси.

Разморозьте центросомы при комнатной температуре и поместите их при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут, чтобы обеспечить правильное зарождение микротрубочек. Пока ждут, приготовьте пробирную смесь на льду. Он должен содержать тубулин, ГТФ, систему поглотителя кислорода, генераторы молекулярных сил, такие как сшивающие агенты микротрубочек, АТФ и систему регенерации АТФ.

После смешивания уменьшите температуру образца в охлажденном роторе Airfuge при давлении 30 фунтов на квадратный дюйм в течение трех минут. Затем добавьте в смесь предварительно нагретые центросомы. Оптимизируйте количество добавляемых центросом, чтобы получить одну или две центросомы на каплю.

Затем используйте эту смесь для получения капель эмульсии, как описано ранее. Для того, чтобы рекрутировать динеин в биотинилированные липиды в коре головного мозга капель, включите GFP-динеин TMR и стрептавидин в водную фазу. На конфокальном микроскопе с вращающимся диском визуализируйте рост микротрубочек через 30 минут при температуре 26 градусов Цельсия.

Во время визуализации рост микротрубочек может быть стимулирован путем повышения температуры до 28 или даже 30 градусов по Цельсию. Для Z-проекций берут стеки с интервалом в один микрон, что должно требовать около 20 изображений на каплю. Перейдите на панель основной камеры, нажмите на Редактировать Z, а затем установите Шаг Z на 1.0.

Нажмите «Далее», чтобы сохранить настройки. Затем установите максимальное линейное усиление ЭМ, щелкнув вкладку «Камера» на панели «Съемка», и сдвиньте полосу усиления ЭМ до 300. Затем установите Время экспозиции на 200 миллисекунд в той же вкладке.

Нажмите «Запись», чтобы сохранить настройки. Для экспериментов с визуализацией в реальном времени делайте Z-проекции каждые две минуты в течение двух часов, сократив время экспозиции примерно до 100 миллисекунд и увеличив Z-интервалы до двух микрон. Для экспериментов с визуализацией в реальном времени используйте чашку PDMS вместо обычной проточной ячейки для максимальной иммобилизации образца.

С использованием описанных протоколов изучали образование астры в каплях водной и масляной эмульсии, содержащих центросомы. Первоначально центросомы свободно диффундируют в замкнутых объемах. Примерно через 20-30 минут становятся видны первые микротрубочки, а диффузия центросом становится ограниченной, поскольку микротрубочки растут против коры головного мозга во всех направлениях.

Когда микротрубочки вырастают длиннее половины диаметра капли, центросомы смещаются к противоположным границам, при этом микротрубочки растут вдоль коры капель. Без стрептавидина димеин диффузно проникает в каплю. Однако при использовании стрептавидина в течение примерно 10 минут после образования капель динеин связывается с биотинилированными липидами.

При просмотре флуоресцентного тубулина в присутствии коркового динеина становится ясно, что центросомы расположены по центру. В то время как в отсутствие динеина центросомы выталкиваются на противоположные стороны капли. Вероятно, это связано с тем, что динеин способствует катастрофам микротрубочек и корковым силам растяжения, что приводит к центрированию астры.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микрофлюидные технологии для создания веретенообразных структур в сферических эмульсионных каплях. После освоения образование капель и визуализация могут быть выполнены в течение двух-трех часов при правильном выполнении. С помощью этой процедуры можно инкапсулировать другие факторы сборки шпинделя для изучения их влияния на морфологию и позиционирование шпинделя.

При использовании хлороформа или PDMS всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.