Микрожидкостных буфера обмена для Помехоустойчивое Micro / клеточной инженерии наночастиц

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать удобную, эффективную и высокопроизводительную технологию микрофлюидной очистки для отделения свободных наночастиц от клеток после клеточной инженерии с наночастицами. Основное преимущество этой технологии заключается в том, чтобы обеспечить быстрое и эффективное удаление несвязанных наночастиц После процедуры обработки клеток мы собираем все наши продукты. Эта технология микрофлюидной очистки клеток обеспечивает эффективное разделение по размеру благодаря дифференциальному эффекту инерционной фокусировки клеток и наночастиц в спиральном микроустройстве.

Он может обрабатывать до 10 миллионов клеток в милле концентрации, что очень полезно для регенеративной медицины, а также для обработки клеток с фиксатором. Эта технология очень востребована в области клеточной инженерии, которая часто использует наночастицы для работы клеток, с целью визуализации или управления функциями. Демонстрировать процедуру будут Хуэй Мин Тай, научный сотрудник моей лаборатории, а также доктор Дэвид Йео, научный сотрудник из лаборатории профессора Си.

Культивируйте мезенхимальные стволовые клетки до конфлюенции более 80% на шестилуночном планшете перед мечением клеток наночастицами. Аналогичным образом культивируют клетки THP-1 с плотностью один миллион клеток на миллилитр. Далее растворите один миллиграмм наночастиц диоксида кремния с одним миллилитром двухсот микромолярного раствора кальциевого красителя.

И перемешайте частички на ночь. Кроме того, изготовьте наночастицы кальция PLGA AM с использованием методов, описанных в показанной здесь ссылке. Смешайте один миллиграмм наночастиц кальция PLGA AM или 150 микрограммов наночастиц кремнезема кальция в 01%-ном растворе поли-л-лизина в воде, дозируя раствор вверх и вниз в течение одной минуты.

А затем дать ему поинкубироваться при комнатной температуре от 15 до 20 минут. Затем центрифугируйте наночастицы. Удалите избыток надосадочной жидкости поли-l-лизина и повторно суспендируйте наночастицы в одном миллилитре питательной среды, соответствующей типу клеток, подлежащих мечению.

Добавьте 1 миллиграмм меченых наночастиц в один миллилитр среды на каждый миллион клеток в культуре. Тщательно пипетируйте смесь клеток, наночастиц и среды в течение одной минуты. А затем выдерживают смесь примерно 24 часа.

После мечения диссоциируйте и собирайте стволовые клетки, а затем повторно суспендируйте их до концентрации от 100 000 до 1 000 000 клеток на миллилитр для микрофлюидной обработки. Используйте меченые клетки THP-1 в той же концентрации. Чтобы изготовить микрофлюидное спиральное устройство, сначала подготовьте мастер-форму для силиконовых пластин с использованием стандартных методов микропроизводства.

Затем тщательно смешайте 30 граммов базового преполимера PDMS и три грамма отвердителя в лодке для взвешивания. Дегазируйте смесь под вакуумом в течение 60 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вылейте смесь PDMS на основную форму, структурированную по образцу спирального канала, осторожно на высоту от пяти до 10 миллиметров.

Затем дегазируйте смесь в течение 60 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все пузырьки не будут устранены. Затем поместите в духовку и убедитесь, что вафля не наклоняется во время отверждения, чтобы обеспечить постоянную высоту устройства.

Высушите PDMS при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов. После остывания вырежьте спиральное устройство PDMS с помощью скальпеля и осторожно снимите плиту PDMS с мастер-формы. Затем с помощью скальпеля обрежьте края устройства, чтобы обеспечить гладкую поверхность для склеивания.

Затем используйте 1,5-миллиметровый биопсийный перфоратор, чтобы создать два отверстия для входных отверстий и два отверстия для выходов. Промойте устройство изопропанолом, чтобы удалить мусор. И сушим прибор в духовке при температуре 80 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем с помощью малярного скотча очистите нижнюю поверхность устройства PDMS и одну сторону предметного стекла. Осторожно поместите предметное стекло и устройство PDMS в плазменную камеру так, чтобы чистые поверхности были открыты. Включите мощность плазмы на максимум, уменьшите давление в камере до тех пор, пока камера не станет розового цвета, и экспонируйте компоненты на 60 секунд.

Затем извлеките затвор и устройство PDMS из камеры. И соедините их вместе, плотно прижав к плазменным поверхностям друг к другу. Убедитесь, что между двумя поверхностями не застряли пузырьки.

Нагрейте склеенное устройство на горячей плите, установленной при температуре 80 градусов Цельсия, в течение двух часов, чтобы укрепить соединение. Отрежьте два куска трубки длиной от 15 до 20 сантиметров для входных отверстий и прикрепите иглу 23 калибра на один конец каждой трубки. Затем отрежьте два куска одной и той же трубки длиной от пяти до 10 сантиметров для выпускных отверстий и прикрепите их к выпускным отверстиям устройства.

Перед обработкой пробы вручную заполните устройство шприцем, содержащим 70% этанола, до тех пор, пока он не потечет из выпускной трубки. Дайте этанолу постоять в устройстве не менее 30 секунд, чтобы стерилизовать его. Затем загрузите 30 миллилитров отфильтрованного PBS с 1% BSA в шприц объемом 60 миллилитров.

Кроме того, загрузите три миллилитра меченых клеток в трехмиллилитровый шприц и убедитесь, что ни в одном из шприцев нет пузырьков воздуха. Удалите пузырьки воздуха, аккуратно вытолкнув несколько капель жидкости из сопла. Подсоедините наконечники входного шприца и трубку к шприцам и закрепите шприцы на шприцевых насосах.

Вставьте трубки в соответствующие входные отверстия устройства и убедитесь, что вдоль трубки нет пузырьков. Теперь, когда флюидика настроена, установите устройство на инвертированный фазово-контрастный микроскоп для визуализации в режиме реального времени в процессе сортировки клеток. Закрепите небольшой стакан для отходов и две 15-миллилитровые трубки рядом с прибором на предметном столике для микроскопа.

Поместите выпускную трубку с обоих выходов устройства в стакан для отходов. Теперь установите соотношение потока образца к буферу оболочки как один к 10, установив скорость потока шприца для образца на 120 микролитров в минуту и шприца с оболочкой на 1 200 микролитров в минуту. Запустите устройство в течение полутора минут, чтобы дать скорости потока шанс стабилизироваться.

Используйте высокоскоростную камеру, чтобы подтвердить наличие инерциально сфокусированных ячеек вблизи внутренней стенки канала под ярким полем с фазовым контрастом. Как только поток будет достигнут в установившемся режиме и устройство начнет работать правильно, поместите выходные пробирки в разные флаконы, чтобы собрать отдельные элюенты из выходного отверстия ячейки и выходного отверстия для отходов. Этот прибор способен правильно сортировать меченую суспензию моноцитарных клеток THP-1 из флуоресцентных наночастиц диоксида кремния.

Была получена высокая эффективность разделения, что подтверждено как высокоскоростной визуализацией, так и анализом проточной цитометрии. Одноступенчатая стратегия очистки обеспечивает непрерывное восстановление меченой суспензии и адгезивных клеток, взвешенных в свежем буферном растворе, без необходимости центрифугирования. Устройство способно с высокой эффективностью разделения как с наночастицами кремнезема, так и с PLGA и может разделять до 10 миллионов клеток на миллилитр с такой же высокой эффективностью.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как маркировать клетки наночастицами. И как очистить меченые клетки, удалив лишние несвязанные частицы с помощью нашего специализированного микрофлюидного устройства.