Микрожидком Платформа Точность Малый объем пробы обработке и использовании в биологических Размер Отдельные частиц с акустической микроустройство

Общая цель этой процедуры заключается в выполнении автоматизированного разделения частиц малого объема с помощью микрофлюидного фотоаппарата. Этот метод может обеспечить выполнение ключевых процедур в области биомедицинской инженерии, включая надежную обработку и разделение образцов для биообнаружения и клинических исследований. Основными преимуществами этого метода являются модульность, точность, надежность и автоматизация, что делает его адаптируемым и гибким не только для ретикетной сепарации, но и для широкого спектра потоков через устройства микрофлюидной сепарации.

Мы впервые осознали необходимость этой возможности для регулярного и надежного разделения субмиллиметровых объемов биологических образцов без значительного разбавления или потери аналита. Интеграция системы дозирования проб и автоматической маршрутизации от источника к файлам сбора вместе со стандартными операциями шприцевого насоса имеет решающее значение для успешной работы в таких масштабах. Для начала спроектируйте акустическое ретикетное устройство и схему для двух фотошаблонов, как описано в первом разделе сопроводительного текстового протокола.

Затем вылепите отверстия для жидкости на боковой полированной кремниевой пластине 1 0 0. Используя стандартную фотолитографию с положительным резистом, протравите эту геометрию с помощью глубокого реактивного ионного травления на глубину от 350 до 400 микрометров. Затем переверните пластину и смоделируйте геометрию канала для жидкости на лицевой стороне.

Опять же, используя стандартную фотолитографию с положительным резистом, затем установите структурированную пластину на вторую пустую кремниевую пластину-носитель. С помощью фоторезиста теперь протравите экспонированные каналы на глубину до 200 микрометров. С помощью глубокого ионного травления замочите пластину устройства в растворе для снятия резистивного сопротивления, чтобы отделить ее от чистой кремниевой пластины.

Далее очистите пластину устройства и безликую пластину из боросиликатного стекла толщиной 0,5 миллиметра с помощью раствора пираньи. После очистки загерметизируйте каналы жидкости ионным соединением стекла и кремниевой пластины, используя условия, показанные здесь. Наконец, разрежьте отдельные стружки алмазным диском на пиле для нарезки кубиками из двухкомпонентного набора эпоксидной смолы с низкой вязкостью.

Взвесьте рекомендуемое соотношение обоих компонентов и тщательно перемешайте их. Затем поместите восемь титанатов циркина или пьезокерамику PCT в подходящий кондуктор и с помощью пипетки равномерно распределите по нему примерно 10 микролитров эпоксидной смеси, чтобы создать тонкий ровный слой. Затем поместите чип в кондуктор и совместите эпоксидную сторону пизокерамики с микрофлюидным чипом.

Возможно, потребуется прикрепить чип лентой, чтобы удерживать его на месте во время выравнивания. Зажмите узел в тисках, стараясь не треснуть ни один из компонентов и отверждения при температуре и продолжительности, рекомендованных производителем эпоксидной смолы. После того, как эпоксидная смола затвердеет, используйте паяльник с тонким наконечником, чтобы прикрепить провода тонкого сечения к каждой стороне пизокерамики.

При необходимости используйте соответствующий флюс для подготовки поверхности пизо. Позаботьтесь о том, чтобы сделать как можно более короткий контакт с пизо, чтобы избежать его термической деполяризации. Прикрепите микросхему к жидкостной макетной плате с помощью зажимных приспособлений.

Кроме того, прикрепите к макетной плате охлаждающий вентилятор для регулирования температуры во время акустических экспериментов. Далее вкручиваем микросхему в мировые разъемы. Установите макетную плату на столик микроскопа и присоединитесь ко всему миру, чтобы соединить микросхемы с дополнительными трубками на входах и выходах.

Использование стандартных четверть 28 резьбовых соединений. Для одной 16-дюймовой трубки подключите микрофлюидный чип к шприцевому насосу, многопортовым клапанам с компьютерным управлением, расходомерам с интерфейсом ПК и трубкам, как показано здесь и описано на рисунке 4 прилагаемого текстового протокола. Перед проведением сепарации заполните резервуары с реагентами для очистки и загрунтуйте соответствующие линии жидкости.

Также установите третий и четвертый клапаны на выходах стружки для первоначального потока к резервуарам для отходов. Далее включите вентилятор охлаждения. Подключите пизокерамические выводы к усилителю мощности и установите генератор функций на резонансную частоту для используемого акустического чипа.

Отрегулируйте установку напряжения на функциональном генераторе таким образом, чтобы РЧ-усилитель выходил в диапазоне от 12 до 25 вольт от пика до пика в соответствии с требуемым разнесением. Затем подключите к системе соответствующие флаконы для сбора и входной флакон буфера. Используйте буфер для образца, подходящий для отделенных клеток или частиц, или в соответствии с требованиями аналитического анализа, который будет использоваться после разделения.

Затем загрузите управляющее программное обеспечение и используйте его для управления клапанами, датчиками расхода и насосом для выполнения полностью автоматической процедуры заправки и сепарации. Непосредственно перед началом процедуры разделения кратковременно пробурьте пробирку с образцом, чтобы повторно суспендировать любые частицы, которые могли осеть. В качестве альтернативы можно дозировать образец вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать биологические образцы, которые более подвержены повреждениям или комкованию из-за вортекса.

Затем подсоедините пробирку с образцом к входной линии и немедленно начните процедуру первичной обработки и сепарации. Начните с использования программного обеспечения для заправки воздухозаборника первого и второго клапанов, чтобы убедиться, что трубка не содержит жидкости. Одновременно загрунтуйте трубку, соединяющую входной флакон буфера со вторым клапаном, а входной флакон для образца — с первым клапаном.

Пусть шприцевой насос извлечет примерно 15 микролитров из обоих флаконов, чтобы полностью заполнить трубки, подсоединив их к клапанам. Наконец, переключите первый и второй клапаны на отходы, чтобы удалить лишнюю жидкость или воздух, попавшие в загрузочный змеевик. Далее настройте программу для загрузки катушки для образца, предварительно откачав 25 микролитров воздуха со скоростью 50 микролитров в минуту.

Затем загрузка 250 микролитров образца со скоростью 200 микролитров в минуту, затем 35 микролитров ведущего буфера со скоростью 200 микролитров в минуту и, наконец, еще 25 микролитров воздуха со скоростью 50 микролитров в минуту. Затем настройте шприцевые насосы на нагнетание загруженных пробок жидкости со скоростью 100 микролитров в минуту и контролируйте скорость потока на выходе мелких и крупных частиц с помощью датчиков потока. Соответствующее соотношение расхода может быть определено, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Когда датчики расхода обнаружат скачок расхода, указывающий на прохождение первого воздушного зазора, переключите соответствующий выходной клапан с пробирки для отходов на пробирку для сбора проб. Убедитесь, что поток стабилен по мере того, как образец проходит через чип и отделяется, наблюдая за показаниями датчика потока. Когда проба проходит через чип, отделенные фракции собираются на выпускных клапанах.

На конце пробной пробки понаблюдайте за датчиком расхода, обнаружьте второй воздушный зазор. На этом этапе переключите выходные клапаны обратно в режим отхода. После того, как весь объем будет выдан, остановите инфузию шприцевого насоса и завершите процедуру автоматизации.

После завершения эксперимента по разделению отсоедините пробирки для сбора мелких и крупных проб частиц и храните их соответствующим образом для последующего анализа. Поместите пробирку для сбора проб в пустые флаконы, чтобы собрать излишки чистящих растворов, которые будут смываться через пробирки. Затем запустите процедуру автоматической очистки системы, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Во время этого процесса программа будет управлять клапанами и шприцевым насосом, чтобы последовательно загружать удерживающий змеевик чистящими реагентами и промывать их через систему. После завершения автоматизированного процесса очистки и обеззараживания избавьтесь от излишков промывочных растворов и флаконов, в которых они собрались, соблюдая соответствующие процедуры обращения с биологическими или химическими отходами. Здесь показано репрезентативное частотное сканирование с помощью хорошо связанного пизо- и микрофлюидного устройства.

Когда связь между пизо и микрофлюидным устройством хороша, частицы плотно фокусируются на резонансной частоте, что приводит к явному пику интенсивности флуоресценции и миграции в ожидаемое положение фокусировки. Напротив, при слабом соединении частицы не будут хорошо фокусироваться, и устройство не подходит, когда высокое качество фокусировки или быстрый поток имеют решающее значение для требуемого применения. Каждая линия на этом графике представляет результаты разделения с использованием частиц полистирола различных размеров и управляющих напряжений пизо.

Как правило, для извлечения более мелких частиц требуется более высокое напряжение. Однако сухое напряжение не может быть увеличено до бесконечности из-за большего рассеивания тепла и усиления эффектов акустического потока. Чтобы продемонстрировать полезность этой платформы для разделения биологических частиц, клетки раджи человека со средним диаметром от 8 до 10 микрометров были пропитаны вирусом денге с приблизительным диаметром 50 нанометров, а затем разделены с помощью акустического микрофлюидного устройства.

После того, как такая система собрана и запрограммирована, разделение может быть выполнено в плановом порядке примерно за пять минут. Можно обрабатывать около трех проб в час с полной очисткой и обеззараживанием между образцами. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как подсчет клеток, вестерн-блоттинг или секвенирование нового поколения, чтобы подтвердить чистоту разделения и выяснить биологическую значимость.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить типичное устройство для микрофлюидной сепарации. Используйте соединения World to Chip для взаимодействия с аппаратным обеспечением и выполняйте автоматизированную процедуру разделения точным и надежным способом. Не забывайте, что работа с инфекционными материалами может быть чрезвычайно опасной и должна проводиться только должным образом обученным персоналом с использованием соответствующего институционально предписанного оборудования и процедур биологической безопасности.