Микрожидком Платформа Точность Малый объем пробы обработке и использовании в биологических Размер Отдельные частиц с акустической микроустройство

Общая цель данной процедуры — выполнение автоматизированного разделения частиц в малых объемах с использованием микрофлюидного фотонного устройства. Этот метод позволяет реализовать ключевые процедуры в области биомедицинской инженерии, включая надежную обработку и разделение образцов для биодетекции и клинических исследований. Основными преимуществами данной методики являются модульность, точность, надежность и автоматизация, что делает ее адаптируемой и гибкой не только для разделения ретикулоцитов, но и для широкого спектра проточных микрофлюидных разделительных устройств.

Сначала мы определили необходимость в данной функциональности для рутинного и надежного проведения разделений биологических образцов в субмиллилитровых объемах без значительного разбавления или потери аналита. Интеграция дозирования образца и автоматизированной маршрутизации от источника к точкам сбора в сочетании со стандартной работой шприцевого насоса имеет критическое значение для успешной работы в таком масштабе. Для начала разработайте устройство акустического ретикулятора и схему двух фотошаблонов, как описано в первом разделе прилагаемого текстового протокола.

Затем нанесите рисунок портов для жидкости на обратную сторону двусторонне полированной кремниевой пластины 1 0 0. Используя стандартную фотолитографию с позитивным резистом, вытравите данную геометрию методом глубокого реактивного ионного травления на глубину от 350 до 400 micrometers. Затем переверните пластину и нанесите рисунок геометрии каналов для жидкости на лицевую сторону.

Снова используя стандартную фотолитографию с позитивным резистом, закрепите структурированную пластину на второй чистой кремниевой подложке. Теперь, используя фоторезист, протравите открытые каналы до глубины 200 micrometers. Применяя глубокое реактивное ионное травление, затем погрузите пластину с устройством в раствор для смывки резиста, чтобы отделить ее от чистой кремниевой пластины.

Затем очистите подложку устройства и безрисуночную боросиликатную стеклянную подложку толщиной 0.5 millimeter с помощью раствора Пиранья. После очистки герметизируйте жидкостные каналы, ионно связывая стеклянную и кремниевую подложки при условиях, показанных здесь. В завершение разрежьте отдельные чипы с помощью алмазного лезвия на станке для резки из набора двухкомпонентного эпоксидного клея низкой вязкости.

Взвесьте оба компонента в рекомендуемом соотношении и тщательно перемешайте их. Затем поместите пьезокерамику из цирконата-титаната свинца (PZT) или ПЦТ в подходящий зажим и с помощью пипетки равномерно распределите примерно 10 µL эпоксидной смеси по ее поверхности, чтобы создать тонкий ровный слой. После этого поместите чип в зажим и совместите сторону пьезокерамики с эпоксидной смесью с микрофлюидным чипом.

Для фиксации чипа во время выравнивания может потребоваться прикрепить его к поверхности с помощью клейкой ленты. Зажмите сборку в тисках, стараясь не повредить компоненты, и проведите отверждение при температуре и в течение времени, рекомендованных производителем эпоксидной смолы. После отверждения смолы с помощью паяльника с тонким жалом припаяйте тонкие провода к каждой стороне пьезокерамики.

При необходимости используйте подходящий флюс для подготовки поверхности пьезоэлемента. Старайтесь обеспечить максимально короткий контакт с пьезоэлементом, чтобы избежать его термической деполяризации. Закрепите чип на флюидной макетной плате с помощью зажимных приспособлений.

Также закрепите охлаждающий вентилятор на макетной плате для регулирования температуры во время акустических экспериментов. Затем прикрутите чип к внешним коннекторам. Установите макетную плату на предметный столик микроскопа и подсоедините внешние коннекторы чипа к дополнительным трубкам на входах и выходах.

Используйте стандартные резьбовые соединения 1/4-28. С помощью трубок диаметром 1/16 дюйма подключите микрофлюидный чип к шприцевому насосу, управляемым компьютером многопортовым селекционным клапанам, расходомерам с интерфейсом ПК и трубкам, как показано здесь и описано на рисунке 4 прилагаемого текстового протокола. Перед началом разделения заполните резервуары с чистящим реагентом и прокачайте соответствующие линии подачи жидкости.

Также установите клапаны три и четыре на выходах чипа так, чтобы изначально поток направлялся в резервуары для отходов. Затем включите вентилятор охлаждения. Подключите выводы пьезокерамики к усилителю мощности и настройте генератор функций на резонансную частоту используемого акустического чипа.

Отрегулируйте заданное значение напряжения на генераторе функций таким образом, чтобы выходное напряжение РЧ-усилителя составляло от 12 до 25 В (от пика до пика), в зависимости от требуемого разделения. Затем подключите к системе соответствующие пробирки для сбора и пробирку с вводным буфером. Используйте буфер для образцов, подходящий для разделяемых клеток или частиц, либо соответствующий требованиям анализа, который будет проводиться после разделения.

Затем загрузите управляющее программное обеспечение и используйте его для управления клапанами, датчиками потока и насосом для выполнения полностью автоматического цикла заполнения системы и разделения. Непосредственно перед началом процедуры разделения кратко перемешайте пробирку с образцом на вортексе, чтобы ресуспендировать частицы, которые могли осесть. В качестве альтернативы, для смешивания биологических образцов, более подверженных повреждению или слипанию при вортексировании, произведите пипетирование образца вверх-вниз 10 раз.

Затем подсоедините флакон с образцом к входной линии и незамедлительно запустите процедуру заполнения и разделения. Сначала с помощью программного обеспечения выполните заполнение воздухозаборника клапанов один и два, чтобы убедиться в отсутствии жидкости в трубках. Одновременно выполните заполнение трубок, соединяющих флакон с буфером с клапаном два и флакон с образцом с клапаном один.

Используя шприцевой насос, заберите примерно 15 µL из обоих флаконов, чтобы полностью заполнить трубки, соединяющие их с клапанами. Затем переключите клапаны один и два в положение слива, чтобы удалить излишки жидкости или воздух, попавшие в загрузочную петлю. После этого настройте программу для загрузки пробоотборной петли, начав с забора 25 µL воздуха со скоростью 50 µL/min.

Затем введите 250 µL образца со скоростью 200 µL/мин, далее 35 µL ведущего буфера со скоростью 200 µL/мин и, наконец, еще 25 µL воздуха со скоростью 50 µL/мин. Затем настройте шприцевые насосы на подачу введенных пробок жидкости со скоростью 100 µL/мин и контролируйте скорость потока на выходах для мелких и крупных частиц с помощью датчиков потока. Соответствующее соотношение потоков можно определить согласно описанию в сопроводительном текстовом протоколе.

Когда датчики потока фиксируют скачок скорости потока, указывающий на прохождение первого воздушного зазора, переключите соответствующий выходной клапан с пробирки для отходов на пробирку для сбора образца. Убедитесь в стабильности потока при прохождении образца через чип и его разделении, контролируя показания датчиков потока. По мере прохождения образца через чип разделенные фракции собираются на выходных клапанах.

В конце пробки образца проследите за датчиком потока и определите второй воздушный зазор. В этот момент переключите выходные клапаны обратно в слив. После подачи всего объема остановите подачу шприцевого насоса и завершите программу автоматизации.

После завершения эксперимента по разделению отсоедините пробирки для сбора образцов мелких и крупных частиц и храните их соответствующим образом для последующего анализа. Закрепите трубку для забора образцов в пустых пробирках для сбора избыточных промывочных растворов, которые будут проходить через трубки. Затем запустите программу автоматической очистки системы, как описано в прилагаемом текстовом протоколе.

В ходе этого процесса программа будет управлять клапанами и шприцевым насосом для последовательной загрузки промывочных реагентов в удерживающую спираль и их последующего пропуска через систему. По завершении процесса автоматической очистки и деконтаминации утилизируйте избыточные промывочные растворы и флаконы, в которых они собирались, в соответствии с надлежащими процедурами обращения с биологическими или химическими отходами. Здесь представлен типичный график частотного сканирования для хорошо сопряженного пьезо- и микрофлюидного устройства.

При качественном сопряжении пьезоэлемента и микрофлюидного устройства частицы плотно фокусируются на резонансной частоте, что приводит к выраженному пику интенсивности флуоресценции и перемещению в ожидаемую позицию фокусировки. Напротив, при плохом сопряжении частицы фокусируются плохо, и такое устройство непригодно в случаях, когда для конкретного применения критически важны высококачественная фокусировка или высокая скорость потока. Каждая линия на этом графике представляет результаты разделения частиц полистирола различных размеров при разных напряжениях возбуждения пьезоэлемента.

Как правило, для извлечения более мелких частиц требуются более высокие напряжения. Однако сухие напряжения нельзя увеличивать бесконечно из-за повышенного тепловыделения и усиливающихся эффектов акустического потока. Чтобы продемонстрировать применимость данной платформы для разделения биологических частиц, клетки линии Raji человека со средним диаметром от 8 до 10 µm были смешаны с вирусом денге с приблизительным диаметром 50 nm, после чего их разделили с помощью акустического микрофлюидного устройства.

После сборки и программирования такой системы разделение может выполняться рутинно примерно за пять минут. В час можно обрабатывать около трех образцов, включая полную очистку и деконтаминацию между ними. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как подсчет клеток, вестерн-блоттинг или секвенирование следующего поколения, для подтверждения чистоты разделения и выяснения биологической значимости.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить типичное микрофлюидное устройство для разделения. Используйте соединения «мир-чип» для сопряжения с оборудованием и проведения автоматизированной процедуры разделения точным и надежным способом. Не забывайте, что работа с инфекционными материалами может быть чрезвычайно опасной и должна выполняться только должным образом обученным персоналом с использованием соответствующего оборудования и процедур биологической безопасности, предписанных учреждением.