Разделение Бусы и клетки в Многоканальные Устройства микрожидкостных Использование Диэлектрофорез и ламинарного потока

Общая цель данной процедуры заключается в манипулировании клетками и микросферами внутри микрофлюидных устройств с помощью диэлектрофореза (DEP) с использованием печатных плат (PCB). Это достигается путем предварительного проектирования и подготовки электродов на печатной плате и микрофлюидных каналов. Вторым этапом процедуры является сборка микрофлюидного устройства на базе печатной платы, а также приготовление растворов микросфер и клеток.

Третьим этапом процедуры является заполнение каналов средой с низкой проводимостью, после чего вводятся микросферы и клетки. Заключительным этапом является подключение платы с микросхемой к усилителю мощности и генератору функций с последующим запуском DEP. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие разделение и манипулирование клетками и микросферами в микрофлюидных устройствах с помощью DEP.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, сталкиваются с определенными трудностями, поскольку для разработки эффективного электрода, работающего в составе микрофлюидного устройства для манипулирования конкретными клетками или микросферами, пользователь должен понимать принципы DEP. С другой стороны, использование печатных плат (PCB) в качестве электродов делает активацию клеток и микросфер в микрофлюидных устройствах доступной для специалистов из различных научных областей. Первым шагом данной процедуры является проектирование электродов на печатной плате (PCB) с необходимой геометрией для создания неоднородного электрического поля.

После завершения проектирования закажите изготовление специализированных электродов на базе печатных плат (PCB) в коммерческом центре по производству электроники. После получения изготовленной по индивидуальному заказу платы откройте упаковку и осмотрите ее для данной демонстрации. Длина печатной платы составляет 8,4 сантиметра, ширина — 2,1 сантиметра.

Ширина металлических электродов составляет пять миллиметров. В данном примере электроды состоят из двух длинных металлических полос и двух поперечных областей длиной 4,5 миллиметра, в которых электроды расположены в виде гребенки. Эти области с перекрестным расположением электродов создают сильное неоднородное электрическое поле для обеспечения соединения стимулятора с электродом печатной платы.

Поместите провод калибра 16 gauge на конец электрода. С помощью разогретого паяльника зафиксируйте провод на металлической области печатной платы. Это приведет к нагреву провода.

Приложите припой к нагретой проволоке и дайте небольшому количеству припоя впитаться в проволоку. После того как проволока будет заполнена припоем, уберите паяльник, удерживая проволоку на месте до остывания припоя. Повторите процесс пайки для другого электрического соединения на печатной плате.

Следующим шагом является подготовка микрофлюидных каналов с требуемым рисунком разветвления. Используя стандартные методы микрофабрикации, создайте мастер-форму для определения каналов с помощью кремниевой пластины и фоторезиста SU-8. Данная мастер-форма имеет один входной канал и три целевых канала.

Ширина каналов составляет 100 micrometers, а высота каналов — 27 micrometers. После создания мастер-формы смешайте полиметилсилоксан или эластомер PDMS с отвердителем в весовом соотношении 10:1 и перемешивайте в течение пяти минут. Залейте жидкий PDMS на предварительно изготовленную мастер-форму из SU-8 и удалите пузырьки воздуха, поместив жидкий PDMS в вакуум на три минуты.

При необходимости повторите процесс вакуумирования до полного удаления всех пузырьков. Для удаления остаточных пузырьков можно использовать струю азота. Отвердите PDMS в печи при 70 °C в течение двух часов.

С помощью лезвия бритвы отделите слой PDMS с микрофлюидными каналами от пластины. Будьте осторожны, чтобы не разбить пластину, при этом сторона с каналами должна быть обращена вверх. Используйте биопсийный панч, чтобы проделать отверстия для подачи жидкостей и клеток в микрофлюидное устройство. Обрежьте края.

Удалите излишки PDMS. Осмотрите микрофлюидное устройство, чтобы убедиться в отсутствии пыли и загрязнений. Используйте клейкую ленту 3M Scotch Magic для очистки PDMS.

Подвергните каналы из PDMS и чистое покровное стекло номер ноль толщиной от 80 до 130 мкм воздействию плазменного газа в течение 1,5 минут. Извлеките пластину с PDMS и покровное стекло из установки плазменной очистки в чашку Петри; прижмите микрофлюидные каналы из PDMS к покровному стеклу для создания плазменной связи. Нагревайте полученную микрофлюидную сборку на нагревательном столе при температуре 100 °C в течение не менее 15 минут. Заключительным этапом подготовки микрофлюидного устройства является позиционирование каналов из PDMS и покровного стекла над электродами печатной платы.

Начните с нанесения примерно 10 µL минерального масла на печатную плату (PCB). Чтобы обеспечить плотный контакт между печатной платой и покровным стеклом, установите узел микрофлюидного канала с покровным стеклом на обработанную маслом печатную плату. Слегка прижмите узел микрофлюидного канала с покровным стеклом, чтобы обеспечить надежный контакт и минимизировать количество пузырьков воздуха, которые могут помешать визуализации клеток и микросфер.

Другим важным этапом является приготовление среды с низкой электропроводностью, состоящей из 8,5% сахарозы и 0,3% глюкозы (масса к объему) в деионизированной воде. Теперь микрофлюидное устройство готово к использованию; с помощью пипетки заполните каждый микрофлюидный канал от 15 до 20 µL среды с низкой электропроводностью, если это необходимо. Для удаления пузырьков воздуха из каналов используйте вакуумную аспирацию.

Следующим шагом является введение тестовых частиц в микрофлюидное устройство. В данной демонстрации используется суспензия из 550 полистирольных микросфер на микролитр среды с низкой проводимостью; поскольку микросферы могут оседать со временем, перед использованием перемешайте суспензию. Затем с помощью пипетки введите 200 µL суспензии полистирольных микросфер в канал.

Следующим шагом является подготовка электродов: подключите выход генератора функций к входу усилителя переменного тока. Затем подключите выход усилителя к проводам электродов. Обмотайте все электрические провода и поверхности установки изолентой, чтобы защитить пользователей от возможного поражения электрическим током.

Настройте генератор функций так, чтобы на выходе формировался синусоидальный сигнал с частотой от 1 до 1,5 МГц. Запустите DEP, чтобы начать сортировку клеток и микросфер в данной установке. Входной канал расположен справа, а три целевых канала разделяются в месте тройного разветвления.

Электроды на печатной плате соответствуют черным полосам при отсутствии ламинарного потока и DEP. При включении DEP частицы остаются практически неподвижными, но без подачи потока. При включении ламинарного потока частицы перемещаются к электродам печатной платы и удаляются из пространства между электродами.

Однако при выключенном DEP частицы, текущие через входные каналы, распределяются между тремя целевыми каналами. При включении DEP и наличии ламинарного потока частицы направляются исключительно в центральный канал. В следующих видео микрофлюидное устройство поворачивали над электродами печатной платы, что приводило к изменению ориентации каналов.

Относительно электродов на печатной плате (PCB). Входной канал, который ранее был перпендикулярен электродам PCB, теперь при включении ламинарного потока расположен почти параллельно им. Однако при выключенном DEP микросферы равномерно entering во все три целевых канала.

При запуске DEP бусины приближаются к точке трифуркации, и сила DEP притягивает их в боковой канал над электродом. На следующих кадрах видео показана смесь клеток аденокарциномы толстой кишки человека (линия HT 29) и флуоресцентных бусин в микрофлюидном устройстве. На данном DIC-изображении открытая стрелка указывает направление ламинарного потока, а каналы обозначены пунктирными линиями.

Отражающие металлические электроды видны в виде светлой полосы на фоне; для визуализации бусин при свечении используется дифференциально-интерференционный контраст (DIC). Интенсивность шкалы. Изображения используются для повышения видимости клеток.

Данное изображение идентично предыдущему, однако представлено в виде изображения интенсивности в шкале glow scale, что позволяет визуализировать как клетки, так и микросферы. Отражающие металлические электроды на этом рисунке выглядят как желтые и зеленые полосы. При воздействии DEP микросферы выходят из правого канала, как показано на DIC-изображении, в то время как клетки HT 29 выходят из центрального и левого каналов, что видно на изображении glow scale до активации DEP. Смешанный раствор клеток и микросфер течет из одного входного канала в три отдельных целевых канала.

После индукции DEP микросферы и клетки селективно перемещаются в разные каналы. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как начать внедрение диаэлектрофореза для манипулирования клетками и микросферами в микрофлюидных устройствах.