Методика адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостатическую

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы дать возможность микроорганизму эволюционировать в лабораторных условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как взаимосвязь функций надпочечников, реакции на стресс, метаболическая инженерия и, конечно же, эволюция. Основным преимуществом этой методики является непрерывный отбор наиболее подходящего потомка в конкретных лабораторных условиях.

Начните эту процедуру с подготовки оборудования, а также исходной среды, среды напряжения и среды с высоким напряжением, как описано в текстовом протоколе. Инокулируйте одну колонию или дикую кишечную палочку дикого типа в 15-миллилитровую пробирку, содержащую четыре миллилитра исходной среды. Инкубируйте пробирку в встряхивающем инкубаторе в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 220 оборотах в минуту.

Инкубируйте банку для хемостата, обеспечивающую аэрацию и перемешивание при температуре 37 градусов Цельсия, в течение шести часов. После инкубации асептически подсоедините конец силиконовой трубки от насосов к банке для хемостата. Асептически переложите один миллилитр предкультуры в банку с хемостатом.

Запустите выпускной насос и собирайте культуру в экспоненциальной фазе. Проверьте оптическую плотность на 600 нанометрах культуры от выходной трубки. Затем запустите впускной насос.

Проверяйте оптическую плотность культуры на расстоянии 600 нанометров от выходной трубки каждые 24 часа. После эксплуатации хемостата в течение 96 часов, что составляет 9,6 полного оборота, поменять резервуар на самую низкую концентрацию высоконапряженной среды. При замене резервуара на среду с более высоким уровнем напряжения клетки могут подвергнуться удару током.

Если плотность клеток слишком низкая, прекратите кормление среды с более высоким уровнем стресса на некоторое время, чтобы восстановить плотность клеток. Если оптическая плотность ниже 0,2, остановите подающий насос на шесть часов. Перезапустите впускной насос и убедитесь, что оптическая плотность превышает 0,2.

Постепенно увеличивайте концентрацию стрессора путем постепенного перехода к резервуару с более высокой концентрацией стрессора. Отбирайте образцы адаптированной культуры всякий раз, когда она достигает этапа адаптации к стрессору, и сохраняйте их для дальнейшего геномного анализа. Для хранения образца смешайте 0,5 миллилитра образца культуры с 0,5 миллилитрами стерилизованного 80% раствора глицерина и храните при температуре 80 градусов Цельсия.

Приготовьте 1,6%-ную пластинчатую среду, содержащую тот же стрессор в той же концентрации, что и в среде. В тарелку 0,1 миллилитра выводной культуры из хемостата и выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. После инкубации выберите отдельные колонии из планшета с помощью стерильной зубочистки и засейте их в 15-миллилитровые пробирки, содержащие тот же стрессор и в той же концентрации среды, что и в хемостате.

Выдерживать в течение шести часов. Перелейте один миллилитр отвара культуры в колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров, содержащую 50 миллилитров среды. Собирайте по 0,5 миллилитра отвара культуры каждый час и измеряйте оптическую плотность на 600 нанометрах.

Сравните скорость роста адаптированного штамма с темпами роста штамма дикого типа с учетом стрессора. Штамм E.coli дикого типа развивался в условиях высокого сукцинатного стресса в течение 270 дней, что соответствует почти 930 поколениям. Всякий раз, когда добавлялся более высокий сукцинатный стресс, концентрация биомассы немедленно снижалась, а затем восстанавливалась.

Здесь показана принципиальная схема хемостата с мутантом, который устойчив к высокому сукцинатному стрессу. Большинство клеток дикого типа вымываются в условиях стресса, и мутант растет еще больше. В конце концов, популяция мутантного потомка увеличивается.

Вторая и третья мутации непрерывно отбираются для хемостата и в конечном итоге доминируют в нем. На этом рисунке показано, что адаптированный штамм рос без задержки в условиях высокого сукцинатного стресса, в то время как штамм дикого типа этого не делал. Аналогичная стратегия может быть применена к адаптивной лабораторной эволюции с использованием хемостата с вариацией стрессоров.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как приобретать и развивать микроорганизм в определенных условиях. Однажды освоив эту технику, ее можно будет сделать уже через пару месяцев. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя вымывать клетки хемостата, добавляя слишком много стресса за один раз, и не забывать проверять оптическую плотность каждый день.

Следуя этой процедуре, можно провести такие методы, как анализ генома и транскриптомный анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какая мутация способствует эволюции стрессоустойчивости?