Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila

Для того чтобы выполнить реконструкцию развивающихся органов у Drosophila melanogaster, нам необходимо определить прямую модель, которая лучше всего описывает распространение света внутри самой куколки. Процедура начинается с выбора белой предкуколки и приклеивания ее на конце капиллярной трубки таким образом, чтобы передняя задняя ось макпы была ориентирована параллельно трубке. Небольшая капиллярная трубка заполняется каким-то флуоресцентным красителем и вставляется в зрачковый корпус.

После тщательной регулировки оси куколку поворачивают на 360 градусов. Изображения получаются под разными углами. Полученные данные флуоресцентного транссветтного освещения используются для определения прямой модели, которая будет использоваться для визуализации развития органа.

Здравствуйте, меня зовут Клаудия, и я работаю в Центре биологии помощи в Массачусетской больнице общего профиля, Гарвардской медицинской школе. Меня зовут Ула Пету из лаборатории Paramount в Гарвардской медицинской школе, и я Даниэль Розански из Института биологической и медицинской визуализации Технического университета Мюнхена и Центра Хелиман в Мюнхене. Сегодня мы покажем вам процедуру трехмерной реконструкции всего тела в Oph Melano Casta.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для визуализации in vivo развития органов во время ученического статуса. Итак, давайте начнем Прежде чем начать. Обратите внимание, что перед этим видео не существует сопроводительного видео, в котором некоторые технические аспекты оптической проекционной томографии объясняются более подробно, чем здесь.

Кроме того, в другом видео объясняется визуализация подготовленных тканей или органов более крупных животных. Для всех экспериментов, описанных в этом видео, будут использоваться трансгены дрозофилы Forge. Это EL A gal four, экспрессируемый в слюнных железах, apteris gal four, который экспрессируется в личиночных предшественниках крыла взрослой особи и грудной клетки, трансген, который производит флуоресцентный белок.

В ответ на четвертую девушку, называемую U-A-S-G-F-P и белую 1118, нефлуоресцентные контрольные самцы, несущие трансгены БАС, скрещиваются с девственными самками, несущими четыре трансгена GAL, для получения ткани. Специфическая экспрессия скрещиваний GFP устанавливается от восьми до 10 девственных самок и самцов на стандартных мухочистителях с посыпкой пекарскими дрожжами. На поверхности флаконы размещаются при температуре 25 градусов Цельсия во влажном инкубаторе в течение 12-часового цикла светлой темноты.

Через два дня после начала скрещивания родителей пересаживают в свежий флакон, а через пять-шесть дней ИМИ начинает заполнять флакон белым PrepU. I выбран для экспрессии GFP под флуоресцентным препарирующим эндоскопом. Выбор белых пре пуй обеспечивает правильную стадию содержания животных, так как они остаются белыми около одного часа.

После зрачка они становятся пигментированными или коричневатыми. GFP сцеживающие пуи аккуратно собирают из флаконов с помощью влажной кисти и помещают в каплю воды или PBS в чашку Петри, которую необходимо протереть от автофлуоресцентных материалов. С помощью кисти они теперь должны быть готовы к томографической визуализации.

Если PrepU I необходимо продолжить старение, чтобы прийти на правильную стадию развития, их можно оставить в чашке Петри с влажным бумажным полотенцем или в чистом флаконе с пищей. Это обеспечит достаточную влажность и правильное проявление для визуализации. PrepU должен быть прикреплен к внутренней части стеклянной капиллярной трубки диаметром 800 микрон.

Покрасьте задний конец зрачка суперклеем, сориентируйте склеенную поверхность предкуколки в трубку таким образом, чтобы передний задний доступ мушки был параллелен трубке. Передняя часть животного будет нависать над капиллярной трубкой. Теперь капиллярная трубка закреплена на вращающемся столике микроскопа.

В вертикальном положении отрегулируйте ось наклона вращающегося предметного столика таким образом, чтобы ось вращения трубки была параллельна пиксельным столбцам ПЗС-матрицы. Изменив положение мухи, приступайте к визуализации. В этом примере животные с флуоресцентными слюнными железами должны быть визуализированы для того, чтобы OPH экспрессировал GFP в их слюнных железах, которые могут быть получены от скрещивания популяций EAG 4 и U-A-S-G-F-P.

Начинаем с установленной предкуколки, освещаем предкуколку возбуждающим лучом и собираем флуоресцентный сигнал GFP. При трансиллюминации поверните PrepU на 360 градусов вдоль его вертикальной оси и получите изображения транс-освещения. Каждому изображению соответствует 10 градусов поворота.

Общее время регистрации зависит от величины флуоресценции и от интенсивности возбуждающего пучка. Обычное время составляет порядка одной минуты. В этом примере будет изображена куколка DSO, экспрессирующая GFP в имагинальных дисках крыла.

Эту куколку можно собрать из флакона помеси четырех акций Aus GAL и U-A-S-G-F-P. Предкуколка монтируется так, как описано выше. Однако, поскольку время визуализации для этого эксперимента составляет около восьми часов, критически важно, чтобы окружающая среда оставалась влажной и при комнатной температуре Чтобы избежать обезвоживания и смерти животного, над возбуждающим лучом помещается затвор, чтобы предотвратить гашение цветочных четверок в интересующей ткани, а также для того, чтобы животное не было обожжено лазерным лучом, как раньше. освещать возбуждающим лучом и собирать флуоресцентный сигнал GFP с помощью транссветового освещения.

Предкуколка полностью повернута вдоль своей вертикальной оси. Во время сбора данных вращение занимает всего одну минуту и повторяется через разные промежутки времени. Чтобы создать серию снимков крыльев во время разработки, данные могут быть получены в течение не менее шести часов со скоростью 100 изображений в час.

Крайне важно, чтобы общая световая экспозиция контролировалась с помощью этого затвора, чтобы предотвратить повреждение или обесцвечивание фотографий. В этом фильме показаны изображения, полученные между стадией PrepU и отвращением головки зрачка. При реконструкции трехмерного изображения необходимо учитывать сильное прямое рассеяние, которое не может быть аппроксимировано диффузией.

Таким образом, чтобы сделать реконструкцию моделью прямого рассеяния распространения света, необходимо определить Для простоты мы пренебрегаем поглощением. Величина рассеяния проверена экспериментально. Для этого инородный объект со стандартизированной флуоресценцией вставляют в нефлуоресцентную белую 1118 предварительную куколку, которую затем сканируют для получения данных прямой модели, начиная с заполнения 100-микронной капиллярной трубки из диоксида кремния флуоресцентным красителем PS 5,5.

Используя капиллярное действие, введите капиллярную трубку в куколку под углом 45 градусов к передней оси, установите PrepU в капиллярную трубку и расположите его соответствующим образом на вращающемся столике, как описано ранее. Теперь осветите предкуколку возбуждающим лазерным лучом с помощью линзы с низкой числовой апертурой и соберите флуоресцентные транссветовые изображения предкуколки. Как было описано ранее, программное обеспечение MATLAB используется для подгонки данных к явной теоретической прямой модели.

Определив правильную прямую модель, мы можем реконструировать слюнные железы и получить покадровую томографическую реконструкцию. Если вы планируете использовать томограф в свободном пространстве, также можно настроить алгоритмы настройки для сопоставления индексов. Во-первых, мы показываем 3D-реконструкцию слюнных желез на ранних стадиях развития.

Для сравнения, гистологическое окрашивание слюнных желез показывает, что реконструкции хорошо коррелируют с гистологией. Этот покадровый фильм о развитии имагинальных дисков крыла был получен с одного живого образца. Для сравнения гистологическое окрашивание диска крыла в одно и то же время по точкам показывает, что реконструкции хорошо коррелируют с гистологией.

Мы только что показали вам, как построить систему для визуализации трехмерных структур в пределах oph in vivo и с течением времени. Это позволяет проследить за нами за морфогенезом у дрозофилы и проследить за развитием крыльев в течение шести часов подряд. При выполнении этой процедуры очень важно выбрать правильную прямую модель для распространения света внутри дрозофилы.

Этот метод может быть использован в сочетании с гистологическими методами для пролить свет на развитие органов во время зрачковых стадий, а также может быть модифицирован для изучения различных организмов аналогичного размера. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.