Полианилиновой на основе датчика нуклеиновых кислот

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе диспергированного в воде полианилина, который может быть использован для обнаружения нуклеиновых кислот без применения меток. Этот метод является экономически эффективным методом обнаружения нуклеиновых кислот. Лаборатории, которые его используют, найдут его простым, надежным и чувствительным.

Основное преимущество метода заключается в том, что он не имеет меток и может быть использован для непосредственного обнаружения РНК и ДНК без необходимости ферментативных манипуляций. Этот метод имеет потенциал для новых диагностических технологий, и, поскольку он не использует метку, его можно использовать для обработки образцов пациента с небольшими манипуляциями. Наглядная демонстрация поможет развеять мифы о сенсоре.

Эта платформа включает в себя науку о полимерах и биологию, которые кажутся очень экзотическими, но на самом деле чрезвычайно просты в реализации. Полностью растворите анилин в 60 мл хлороформа в колбе с круглым дном объемом 250 мл. После перемешивания при 600 об/мин в течение пяти минут охладите до нуля до пяти градусов Цельсия со льдом.

Обычно это занимает от 15 до 20 минут. Затем добавьте додецилбензолсульфонат натрия в анилиновый раствор в колбе с круглым дном, помешивая при 600 об/мин. Растворите персульфат аммония в 20 мл воды и добавляйте его по каплям в течение 30 минут, чтобы избежать перегрева реакции.

Проводите реакцию при температуре от нуля до пяти градусов Цельсия в течение 24 часов. Наблюдайте, как реакционная смесь сначала становится молочно-белой через 15 минут, затем темно-коричневой через два часа и, наконец, темно-зеленой через 24 часа. Затем дайте ему нагреться до комнатной температуры еще 24 часа.

Отфильтруйте раствор додецилбензолсульфоната натрия PANI с помощью воронки Бюхнера. Смешайте фильтрат с 80 мл хлороформа и 120 мл воды в разделительной воронке. Инкубируйте раствор в течение 24 часов при комнатной температуре, затем соберите темно-зеленый PANI из сепарационной воронки, оставив непрореагировавшие додецилбензолсульфонат натрия и APS в водной надосадочной жидкости.

Развести раствор PANI в 10 раз с хлороформной водой, затем смешать 200 микролитров разведенного PANI с 6,4 микромолями олигонуклеотидов зондовой ДНК путем легкого покачивания в течение 15 минут в микрофуге-пробирке. Облучайте раствор PANI DNA 1200 микроджоулями на квадратный сантиметр ультрафиолетового излучения в сшивающем агенте в течение двух минут. Крайне важно, чтобы воздействие ультрафиолета было ограничено указанным количеством.

Длительное воздействие ультрафиолета нарушает изменение флуоресценции PANI, вероятно, из-за ковалентной перекрестной утечки PANI и ДНК. Пеллетные комплексы центрифугируют при 17 000 х г в течение шести минут и промывают фосфатно-соевым буфером или PBS. После повторного гранулирования повторно суспендировать в PBS.

Добавьте восемь микролитров 100 микромолеров комплементарных олигонуклеотидов ДНК или нуклеиновых кислот-мишеней к 200 микролитрам зондовых комплексов PANI. Проводят гибридизацию, покачивая растворную смесь в течение 15 минут при температуре 40 градусов Цельсия. После гранулирования комплексы PANI методом центрифугирования при 17 000 х г в течение шести минут промыть PBS и повторно суспендировать в воде.

Добавьте PANI из различных методов обработки в 96-луночный микропланшет и измерьте эмиссионную флуоресценцию в диапазоне от 270 до 850 нанометров путем возбуждения на 250 нанометрах. Пик излучения для PANI должен наблюдаться на отметке около 500 нанометров. Для проведения флуоресцентного микроскопического измерения гибердизированного дуплекса нанесите слой PANI на боросиликатное стекло, нанесите его и высушите при 40 градусах Цельсия в течение 48 часов.

Добавьте восемь микролитров зонда 100 микромолер на высохшую пленку PANI, затем облучайте ее ультрафиолетовым светом в течение двух минут. После облучения промойте пленку зонда PANI с помощью PBS и высушите при температуре 40 градусов Цельсия в течение 48 часов. Проводите гибридизацию в течение 15 минут, добавляя целевые нуклеиновые кислоты.

Это может быть биологический образец или контролируемая мишень олигонуклеотид. Затем промывка PBS. Получение флуоресцентных изображений с 40-кратным увеличением с помощью фильтра длиной 500 нанометров.

Здесь показано электростатическое взаимодействие PANI и ДНК-зондов, усиленное ультрафиолетовым излучением. Гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени запускает образование дуплекса, изменяя структурное подтверждение, что приводит к диссоциации мишени зонда от поверхности PANI. На этом рисунке показано изменение флуоресценции PANI при отсутствии или присутствии зонда, как в растворе, так и в твердой среде покрытия.

Увеличение флуоресценции происходит за счет потока электронов из отрицательно заряженной ДНК, увеличивающего электронную плотность полимера. При гибридизации комплементарных целевых олигонуклеотидов зонды отделяются, что приводит к восстановлению флуоресценции базилика. И наоборот, гибридизация с одиночными несовпадающими олигонуклеотидами-мишенями не приводит к восстановлению флуоресценции базилика.

Основное новшество этой методики заключается в том, что она использует мягкий ультрафиолетовый излучение для точного взаимодействия, что фактически помогает ей различать неспецифические и световые взаимодействия. После освоения этой техники может потребоваться до двух часов, не считая времени на ощущения и высыхание покрытий. Пробуя эту процедуру, важно помнить, что ДНК растворяется в воде, и кислый чай фактически изменяет электронные свойства PANI.

После просмотра этого видео зрители должны хорошо понимать, как синтезировать дисперсный в воде полианилин и использовать его флуоресцентные свойства для обнаружения нуклеиновых кислот. Они смогут иммобилизовать ДНК зондов и проводить гибридизацию для обнаружения мишеней. Работая с мономером, важно помнить, что этот синтез опасен и должен проводиться в капюшоне с защитными средствами, такими как защитные очки, перчатки и лабораторные халаты.