Скрининг на эндокринную активность в воде с использованием коммерчески доступного In Vitro Трансактивационную Биотесты

Протокол для скрининга эндокринной активности в органических экстрактах образцов воды, включая очищенные сточные воды сточных вод и поверхностную (принимающую) воду, был адаптирован с использованием коммерчески доступных биопроб на трансактивацию in vitro.

Общая цель этой стандартизированной процедуры заключается в скрининге образцов воды на эндокринные активные химические вещества с использованием коммерчески доступных анализов клеток на основе рецепторов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мониторинга качества воды, такие как: действительно ли эндокринные активные химические вещества присутствуют в образце? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить анализ на группу эндокринных активных соединений гораздо быстрее, чем существующие химические методы.

Этот метод может помочь диагностировать проблемы с качеством воды, возникающие из-за присутствия химических веществ, разрушающих эндокринную систему. Этот метод дает представление о загрязнителях в воде, но его также можно применять к другим экологическим матрицам, таким как отложения и ткани. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что он требует высокой точности при использовании методов пипетирования.

Для начала этой процедуры необходимо подготовить пробу воды в исходных растворах пробирной среды и референтного химиката, как указано в текстовом протоколе. Специализированную среду для анализа храните при температуре четыре градуса Цельсия для длительного хранения. Далее добавьте 15 микролитров соответствующего эталонного химического запаса в 285 микролитров пробирной среды в стерильной пробирке.

Перемешайте образец, пипетируя вверх и вниз. Затем добавьте 200 микролитров 5%-ного ДМСО в среду для анализа в восемь дополнительных пробирок. Переложите 100-микролитровую аликвоту из первой пробирки во вторую, чтобы начать трехкратную серию разведения.

Разведенный образец в двух пробирках тщательно перемешайте с помощью пипетки. Затем переложите 100-микролитровую аликвоту из второй пробирки в третью. Продолжайте этот процесс для каждой пробирки.

Затем приготовьте контрольный образец растворителя, смешав 10 микролитров ДМСО со 190 микролитрами пробирной среды. Далее соберите и промаркируйте четыре новые пробирки. Добавьте в первую пробирку 95 микролитров пробирной среды.

Затем добавьте пять микролитров водного экстракта и тщательно перемешайте. Добавьте 50 микролитров 5%-ного ДМСО в среду для анализа в остальные три пробирки. Затем выполните двукратное разведение, переложив 50 микролитров раствора из одной пробирки в другую.

Начните с того, что достаньте флакон с клетками, задержанными делением ER или GR, из криогенной морозильной камеры. Быстро разморозьте ячейки, поместив флакон на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия с легким помешиванием в течение двух минут. Затем обеззаражьте флакон 70% этанолом.

Поместите его в шкаф биологической безопасности второго класса. Откройте флакон с помощью асептических методов и перенесите клетки в 10 миллилитров пробирной среды. Центрифугируйте при 200 умноженных на g в течение пяти минут.

Когда центрифугирование будет завершено, используйте стерильную стеклянную пипетку для аспирации надосадочной жидкости. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в шести миллиметрах пробирной среды. Смешайте пять микролитров клеточной суспензии с пятью микролитрами раствора жизненно важного окрашивания.

Затем добавьте аликвоту в счетную камеру. Подсчитайте количество живых клеток с помощью светового микроскопа или автоматического счетчика клеток. Затем оцените плотность живых клеток в клеточной суспензии.

При необходимости разбавляют, чтобы получить окончательную плотность 550 000 живых клеток на миллилитр исследуемой среды. Начните с создания макета планшета, который включает в себя калибровочную кривую из девяти пунктов, образцы QA/QC и множественные разведения для каждого водного экстракта. Добавьте 90 микролитров пробирной среды в контрольные лунки для репликации бесклеточных клеток.

Вылейте клеточную суспензию в стерильный резервуар для пипетирования. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 90 микролитров клеточной суспензии в остальные лунки. Добавьте 10 микролитров разведенных образцов в соответствующие лунки.

Накройте тарелку крышкой. Затем поместите планшет в инкубатор с температурой 5% C02 при температуре 37 градусов Цельсия на 16 часов. После завершения инкубации дайте планшету сбалансироваться до комнатной температуры.

Тогда следующие действия следует проводить при отсутствии прямого света. Приготовьте шестикратное загрузочное решение в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте по 20 микролитров загрузочного раствора в каждую лунку.

Добавьте в каждую лунку по 10 микролитров реагента для жизнеспособности клеток, чтобы оценить цитотоксичность разведенного водного экстракта. Заклейте пластину алюминиевой клеевой пленкой. Затем выдержите тарелку в темноте при комнатной температуре в течение двух часов.

После завершения инкубации добавьте планшет к считывателю микропланшетов с возможностью нижнего считывания. Измерьте флуоресценцию и проанализируйте данные, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании были проанализированы четыре 24-часовые композитные пробы очищенных городских сточных вод, шесть лабораторных проб поверхностных вод из пресноводных систем в Южной Калифорнии и полевая заготовка, состоящая из ультрачистой воды.

Активность ER была обнаружена в семи из 10 репрезентативных проб воды, в то время как активность GR была обнаружена в четырех. Рекомендации по проведению QA/QC для анализов рецепторов эстрогена и глюкокортикоидов можно посмотреть здесь. Результаты исследования по цитотоксичности и точности отбора проб вполне соответствовали критериям приемлемости, что подтвердило достоверность измерений проб воды.

Самые высокие эквивалентные концентрации в биопробах были обнаружены во вторичных сточных водах, в то время как активность ГР третичных сточных вод оказалась ниже предела обнаружения в биопробе. Аналогичным образом, большинство проб поверхностных вод не проявляли активности ГР выше предела обнаружения и имели гораздо более низкие уровни активности ОР, чем вторичные стоки. Большинство образцов сточных вод очистных сооружений показали реакцию на дозу выше предела обнаружения как для биотестов ER, так и для GR.

Репрезентативные результаты для среднего отношения синей и зеленой флуоресценции этих образцов, построенные в зависимости от относительного коэффициента обогащения, можно увидеть здесь. Эту технику можно выполнить за 24 часа, если она выполнена правильно. Пытаясь это сделать, важно следовать всем рекомендациям по обеспечению и контролю качества.

Этот метод проложил путь менеджерам к изучению альтернативных подходов к мониторингу химических веществ, разрушающих эндокринную систему, в воде. Не забывайте, что работа с азидом натрия может быть опасной. Следует принимать меры предосторожности, такие как работа в исправно функционирующем вытяжном шкафу.