Анализ активности рецепторов эстрогена для скрининга эстрогенной эстрогенной активности

Эстрогены — это стероидные гормоны, которые действуют как эндокринные сигнальные молекулы и связываются с ядерными рецепторами — рецепторами эстрогена бета, образуя комплексы эстроген-бета-рецепторов.

Эти лиганд-рецепторные комплексы димеризуются и образуют гомодимеры в цитоплазме клетки. Полученный гомодимер попадает в ядро, связывается с ответным элементом эстрогена, ERE — специфической последовательностью ДНК в промоторе гена-мишени — и инициирует транскрипцию.

Для определения эстрогенной активности фитоэстрогенов — вторичных метаболитов растительного происхождения, имитирующих функцию эстрогенов, — начинают с многолуночного планшета, содержащего репортерные клетки, взвешенные в соответствующей среде.

Репортерные клетки спроектированы таким образом, чтобы сверхэкспрессировать рецепторы эстрогена бета и трансфицированы геном люциферазы, слитым с промотором ЭРЭ. Добавьте раствор образца, содержащий фитоэстрогены, и инкубируйте.

Во время инкубации фитоэстроген связывается с рецепторами эстрогенов, бета — экспрессируется в репортерных клетках. После связывания комплексы фитоэстроген-рецепторы димеризуются и транслоцируются в ядро.

Внутри ядра димеризованный комплекс связывается с ERE. Связывание инициирует транскрипцию гена люциферазы, продуцируя фермент люциферазу. Далее удалите среду и добавьте реагент, содержащий субстрат для люциферазы. Инкубируйте для того, чтобы экспрессированный фермент люциферазы окислил свой субстрат и получил люминесценцию.

Измерьте люминесценцию, которая подтверждает эстрогенную активность соединения в образце.

Сделайте образцы вихревыми. Затем добавьте 4 микролитра каждого образца к 496 микролитрам среды для скрининга соединений, чтобы получить 0,8% раствор ДМСО.

Продезинфицируйте внешнюю поверхность предварительно нагретой пробирки для восстановления клеток 70% этанолом и перелейте 10 миллилитров среды в пробирку с замороженными репортерными клетками, чтобы разморозить их. Закройте трубку с репортерными ячейками и поместите ее на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 5-10 минут.

После извлечения клеток из водяной бани осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы разбить агрегаты клеток и получить однородную суспензию. Затем очистите поверхность трубки 70% этанолом.

С помощью многоканальной пипетки введите 100 микролитров суспензии репортерных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем распределите по 100 микролитров образцов в трех экземплярах в соответствующие лунки. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 22-24 часов.

Непосредственно перед окончанием инкубации планшетов извлеките из холодильника подложку для обнаружения и буфер для обнаружения и поместите их в место с низкой освещенностью, пока они не уравновесятся до комнатной температуры. Затем аккуратно переверните каждую трубку, чтобы перемешать растворы.

Непосредственно перед завершением инкубации планшета вылейте все содержимое буфера для детектирования в пробирку с субстратом для детектирования, чтобы создать реагент для детектирования люциферазы. Аккуратно перемешайте трубку, чтобы не образовалась пена.

Выбросьте содержимое планшета с образцом в соответствующий контейнер для отходов и аккуратно постучите его по чистому впитывающему бумажному полотенцу, чтобы удалить последние капли из лунок. Добавьте по 100 микролитров реагента для обнаружения люциферазы в каждую лунку и дайте планшету для анализа отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем количественно измерьте люминесценцию с помощью 96-луночного люминометра.