High Resolution Количественный Synaptic Протеом профилирование мозга мыши регионов После обучения Слуховые дискриминации

Общей целью этого протеомного подхода является характеристика молекулярной реорганизации в синапсах после обучения и формирования памяти для понимания основных механизмов и сигнальных путей. Основным преимуществом этого метода является безгипотетический подход, позволяющий проводить крупномасштабную количественную оценку и характеристику посттрансляции и модификаций в синаптических протеомах. Наш налаженный рабочий процесс позволяет установить корреляцию между определенным молекулярным изменением и определенным поведением.

Обучение и формирование памяти основаны на изменениях синаптической эффективности, и поэтому протеомные исследования должны быть больше сосредоточены на анализе синаптических структур, таких как синаптосомы, чем на гомогенатах из тканей мозга. Протеомные результаты представляют собой очень сложные наборы данных, поэтому требуют биоинформационной обработки. Начните обучение с помещения тестовой мыши в тускло освещенный челночный бокс в звуконепроницаемой камере.

Используйте полностью контролируемый компьютером график обучения для обучения слуховой дискриминации. Начните с периода привыкания в три минуты молчания перед началом тренировки. Во время испытаний го животное должно преодолеть барьер в течение шести секунд после подачи тона, чтобы нанести удар.

Во время испытаний без хода животное должно оставаться в текущем отсеке коробки челнока в течение шести секунд подачи тона. Проведите 30 попыток и 30 попыток без попыток в псевдорандомизированном порядке, с интервалом между испытаниями 20 секунд, чтобы один сеанс состоял из 60 попыток и длился около 25 минут. После того, как все испытания будут выполнены, верните обученную мышь в домашнюю клетку до жертвоприношения.

Пожертвовав мышью и удалив мозг, локализуйте слуховую кору с помощью визуальных ориентиров, включая кровеносные сосуды и форму поверхности. Затем с помощью скальпеля и иглы двусторонне рассеките слуховую кору как прямоугольный тканевый блок. Используя chiasma opticum в качестве ориентира, препарируйте лобную кору как срез мозга между Bregma 3.56 и 1.54.

Расчлените полосатое тело как срез мозга между Bregma 1,54 и 0,5. И аккуратно удалите корковую ткань. Рассеките гиппокамп, стабилизируя мозг иглой через мозжечок и раскручивая кору, начиная с затылочной доли.

При шоковой заморозке образцы мозга препарировались в жидком азоте. Начните очищение синаптосом, перенеся расчлененную ткань мозга в гомогенизационные сосуды, содержащие один миллилитр ледяного буфера А. Затем гомогенизируйте ткань при 900 оборотах в минуту, используя около 12 ударов. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение 10 минут.

После центрифугирования сохраните надосадочную жидкость. Повторно гомогенизируйте гранулы, как и раньше, и соедините надосадочную жидкость. Вращайте комбинированную надосадочную жидкость в течение 20 минут при 12 000 раз по Г. Повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре гомогенизационного буфера и гомогенизируйте с шестью ходами при 900 об/мин с последующим центрифугированием при 1 200 G в течение 20 минут.

Во время центрифугирования для получения гранул Р2 готовят ступенчатые градиенты сахарозы в ультрацентрифужных пробирках. Начните с 2,5 миллилитров 1,0-молярного буфера сахарозы, а затем используйте стеклянную пастеровскую пипетку для подслоя 1,5 миллилитра 1,2-молярного буфера сахарозы. После центрифугирования добавьте 0,5 миллилитра 0,32 молярного буфера сахарозы в гранулы Р2.

Затем повторно гомогенизируйте с помощью шести ударов. Загрузите гомогенизированные фракции поверх градиентов. Поместите загруженные градиенты в качающийся ротор ковша, а затем вращайте при перегрузке 85 000 раз в течение двух часов в ультрацентрифуге.

После завершения центрифугирования выбросьте верхний слой сахарозы 0,32, включая материал на границе раздела с буфером сахарозы 1,0. Соберите синаптосомы на границе буфера сахарозы от одного до 1,2 моляра. Добавьте 0,32 молярного буфера сахарозы к синаптосомальной фракции в соотношении 1,1.

Тщательно перемешайте и вращайте при 150 000 G в течение одного часа. Синаптосомы находятся в грануле и могут быть повторно суспендированы в буфере для дальнейшей обработки. Растворите синаптосомы каждой области мозга животного в 20-50 микролитрах 8 моляров мочевины путем инкубации на льду в течение одного часа в ультразвуковой ванне.

Разбавьте одним процентом съемного моющего средства, чтобы обеспечить концентрацию двух моляров мочевины. После определения относительного количества белка с помощью пипетки SDS-PAGE одну треть остатка каждого образца поместите в новую пробирку. Выполните варгедирование в растворе, добавив два миллимолярных бикарбоната DTT и 25 миллимолярных бикарбонатов аммония, и осторожно перебейте образец в вихревом состоянии.

Уменьшите количество образцов в течение 45 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Добавьте 10 миллимолярных йота ацедомида к остаткам карбамидометилата цистеина и перемешайте. Выдерживать 30 минут в темноте при температуре 20 градусов Цельсия.

Наконец, добавьте один микролитр стокового раствора трипсина и инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение 12 часов. Чтобы удалить расщепляющееся кислоту моющее средство, добавьте трифторуксусную кислоту до конечной концентрации одного процента и инкубируйте еще час при температуре 20 градусов Цельсия. После центрифугирования образцов при 16 000 G в течение 10 минут тщательно соберите надосадочную жидкость.

Поместите колонну твердофазной экстракции в штатив и уравновесьте матрицу двумя миллилитрами метанола. После промывки добавьте еще два миллилитра буфера B и загрузите образец. После трехкратной промывки буфером B разбавьте пептиды, добавив 200 микролитров 70 процентов ацетонитрила и 0,1 процента трифторуксусной кислоты.

Затем высушите очищенные образцы в вакуумной центрифуге. В этом примере животные, обученные выполнению задания на распознавание FM-тона, показывают возрастающую частоту попаданий и уменьшающуюся частоту ложных тревог в течение сеансов обучения. Значительная дискриминация происходит с четвертого сеанса.

Относительная синаптическая распространенность выбранных белков сравнивается между мышами, обученными на задаче на различение тона FM, и наивными контрольными мышами через 24 часа после первой тренировки. После тренировки уровни белка CYFP2 изменяются во всех исследуемых областях. Не забывайте, что животные часто проявляют часто внутрииндивидуальную изменчивость.

Поэтому настоятельно рекомендуется включить в исследование не менее пяти или более биологических реплик хорошо подобранных групп животных. Как только этот метод будет установлен, он может быть легко адаптирован к другим видам. Например, он использовался для мониторинга изменений экспрессии белков, зависящих от обучения, в мозге одной плодовой мушки.